毛細(xì)管電色譜(ＣＥＣ)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種微分離分析技術(shù),它是利用電滲流或電滲流結(jié)合壓力來(lái)推動(dòng)流動(dòng)相移動(dòng)的一種液相色譜分離方法。由于ＣＥＣ主要依靠平板式的電滲流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相,因此它同時(shí)具有毛細(xì)管電泳的高分辨率以及高效液相色譜的多選擇性。ＣＥＣ出現(xiàn)于１９７４年直到８０年代才受到人們的重視。ＣＥＣ在發(fā)展之初以填充柱為主,但是制作柱端塞子的重復(fù)性影響了其進(jìn)一步的發(fā)展;隨后發(fā)展起來(lái)的開(kāi)管交聯(lián)鍵合柱雖然避免了塞子的制作,但是它需要一定的專門(mén)制柱技術(shù);而物理吸附涂層柱雖然制柱簡(jiǎn)單,但是卻存在柱壽命短的問(wèn)題。１９９３年Ｇａｒｎｅｒ等提出了動(dòng)態(tài)ＣＥＣ的概念,首先在空管石英毛細(xì)管柱上涂漬ＯＶ-１７Ｖ,然后在緩沖液中加入十六烷基三甲基溴化銨(ＣＴＡＢ),由于非極性相互作用,使ＣＴＡＢ動(dòng)態(tài)吸附于柱的內(nèi)表面,從而形成了以ＣＴＡＢ為假固定相的動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ。最近,Ｙｅ等以填充硅膠柱為分離柱,在緩沖液中加入ＣＴＡＢ,利用正負(fù)電荷相吸的原理實(shí)現(xiàn)了以ＣＴＡＢ為假固定相的動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ。本文以未經(jīng)柱壁處理的開(kāi)管石英毛細(xì)管,在緩沖液中加入ＣＴＡＢ或１,５-二甲基-１,５-二氮雜十一烷亞甲基聚Ｎ-甲溴化物（hexadi methrine bromide ,ＨＤＢ）,以及負(fù)電性的磺丁基β-環(huán)糊精(ＳＢＥ-β-ＣＤ),實(shí)現(xiàn)了雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ的手性分離:石英表面的硅羥基解離而帶負(fù)電,由于靜電相吸柱內(nèi)壁首先與緩沖液中帶正電的ＣＴＡＢ或ＨＤＢ吸附形成第一動(dòng)態(tài)吸附層,使柱內(nèi)壁帶正電;然后再與緩沖液中負(fù)電性的ＳＢＥ-β-ＣＤ吸附形成第二動(dòng)態(tài)吸附層。以堿性的丙比胺和酸性的華法林作為拆分對(duì)象,考察了雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ的手性分離能力及動(dòng)態(tài)吸附柱的重復(fù)性。
１實(shí)驗(yàn)部分
１.１試劑與儀器
ＢｉｏＦｏｃｕｓ３０００型高效毛細(xì)管電泳儀(Ｂｉｏ-Ｒａｄ公司,美國(guó));ｐＨＳ-３Ｃ型精密酸度計(jì)(上海電光器件廠);石英毛細(xì)管柱為０．３５ｍ×５０μｍＩＤ，有效長(zhǎng)０．３０ｍ(河北永年光導(dǎo)纖維廠)。ＳＢＥ-β-ＣＤ（實(shí)驗(yàn)室自制,平均取代度為３．８）,手性樣品均為外消旋體(Ｓｉｇｍａ公司,美國(guó)),其它試劑均為分析純,所用水為二次去離子水。
１．２電泳條件
柱子在每天運(yùn)行前用０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ及運(yùn)行緩沖液分別洗柱５ｍｉｎ,每?jī)纱芜\(yùn)行之間用運(yùn)行緩沖液洗柱５ｍｉｎ。進(jìn)樣采用壓力方式:１３．８ｋＰａ·ｓ;分離電壓為１５ｋＶ;紫外２１０ｎｍ檢測(cè);分離柱溫２５℃。
２結(jié)果與討論
２.１ ｐＨ值對(duì)雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ手性分離的影響
配制含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．４ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及１０ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ的緩沖液,ｐＨ在２．０到９．０之間,考察ｐＨ值對(duì)雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ的手性分離性能的影響。石英毛細(xì)管Ｓｉ—ＯＨ的ｐＩ＜２,當(dāng)ｐＨ＞２時(shí)Ｓｉ—ＯＨ解離后帶負(fù)電（Ｓｉ-Ｏ-）,緩沖液中的正電性表面活性劑與其靜電相互作用,使柱內(nèi)表面形成第一動(dòng)態(tài)ＣＴＡＢ層,從而使柱子的內(nèi)表面帶正電,之后再靜電吸附一層負(fù)電性的ＳＢＥ-β-ＣＤ，形成第二動(dòng)態(tài)吸附層,所以在所考慮的ｐＨ值范圍內(nèi)電滲流始終由正極流向負(fù)極。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳(ＣＺＥ)中隨著ｐＨ值的增大,酸性化合物所帶的負(fù)電荷增多,而堿性化合物所帶的正電荷則減少,因此隨著ｐＨ值的增大酸性化合物的有效電泳遷移率顯著增大,而堿性化合物則顯著減小。但是在雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ中ｐＨ值對(duì)酸、堿性化合物的有效電泳遷移率（μｅｆｆ）的影響不大,這是因?yàn)樵陔p動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ中,由于ｐＨ值的增大使Ｓｉ—ＯＨ解離增大,因此柱壁動(dòng)態(tài)吸附的ＳＢＥ-β-ＣＤ增多,分析物質(zhì)與柱壁固定相的作用增強(qiáng),使得正電性的丙比胺與流動(dòng)相中的ＳＢＥ-β-ＣＤ作用的機(jī)會(huì)減少,從而減小了其被流動(dòng)相中的ＳＢＥ-β-ＣＤ包結(jié)后向正極遷移的機(jī)會(huì);而負(fù)電性的華發(fā)林則由于與柱壁ＳＢＥ-β-ＣＤ作用增強(qiáng),減小了它向正極遷移的速度。
ｐＨ值對(duì)分離度的影響見(jiàn)圖１,其中丙比胺在ｐＨ３．０時(shí)的分離度(Ｒｓ)最大(為２．５５)，而華發(fā)林在ｐＨ為６．０時(shí)Ｒｓ最大(為２．３１,當(dāng)ｐＨ＜６．０時(shí),華發(fā)林在３０ｍｉｎ內(nèi)不出峰)，這說(shuō)明ｐＨ值對(duì)Ｒｓ的影響主要取決于分析物質(zhì)本身的解離情況。
２．２ＣＴＡＢ濃度對(duì)手性分離的影響
選擇含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、１０ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ及ＣＴＡＢ濃度在０到１．２ｍｍｏｌ／Ｌ之間的緩沖液體系（ｐＨ３．０）。隨著ＣＴＡＢ濃度從０．１ｍｍｏｌ／Ｌ增大至１．２ｍｍｏｌ／Ｌ,柱內(nèi)壁所吸附的ＳＢＥ-β-ＣＤ增多,因此柱壁固定相相對(duì)于緩沖液中的ＳＢＥ-β-ＣＤ對(duì)丙比胺的作用增強(qiáng),使丙比胺被流動(dòng)相中ＳＢＥ-β-ＣＤ包結(jié)后向正極遷移的機(jī)會(huì)減少,從而使其μｅｆｆ逐漸增大(見(jiàn)圖２);但是在ＣＴＡＢ由０增至０．１ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí)丙比胺的μｅｆｆ逐漸減小,這可能是緩沖液的離子強(qiáng)度和粘度隨ＣＴＡＢ濃度增大而增大起主導(dǎo)作用所至。
ＣＴＡＢ濃度對(duì)丙比胺Ｒｓ的影響見(jiàn)圖３,隨著ＣＴＡＢ濃度由０增至０．２ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｒｓ逐漸增大,這是動(dòng)態(tài)吸附層中的ＳＢＥ-β-ＣＤ增多的緣故,而隨著ＣＴＡＢ由０．２增至１．２ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí),Ｒｓ逐漸減少,這可能是由于當(dāng)ＣＴＡＢ與Ｓｉ—Ｏ-吸附飽和后,再增加ＣＴＡＢ的濃度已不會(huì)再增加動(dòng)態(tài)吸附層中的ＳＢＥ-β-ＣＤ的濃度,反而會(huì)使其與分析物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性地與ＳＢＥ-β-ＣＤ作用。
２．３ＳＢＥ＿β＿ＣＤ含量對(duì)手性分離的影響
選擇含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４及０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ的緩沖液（ｐＨ３．０）,改變ＳＢＥ-β-ＣＤ的含量在０～１０ｇ／Ｌ之間。隨著緩沖液中ＳＢＥ-β-ＣＤ含量的增加,柱壁與流動(dòng)相中的ＳＢＥ-β-ＣＤ的含量都相應(yīng)增加,因此一方面使丙比胺與流動(dòng)相和固定相中的手性選擇劑之間的作用機(jī)會(huì)增多,使丙比胺的Ｒｓ逐漸增大,另一方面使丙比胺的μｅｆｆ逐漸減小。
２．４不同陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)手性分離的影響
由表１可知在ｐＨ３．０時(shí)陽(yáng)離子表面活性劑ＨＤＢ比ＣＴＡＢ所形成的雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ在低ＳＢＥ-β-ＣＤ含量的情況下對(duì)丙比胺有較大的分離能力,這是由于ＨＤＢ是聚合物,每一單體含兩個(gè)正電荷(單位碳原子所含的正電荷比ＣＴＡＢ多),使柱內(nèi)表面動(dòng)態(tài)吸附ＨＤＢ的量比ＣＴＡＢ多,因此在形成第二動(dòng)態(tài)吸附層時(shí)能吸附較多的ＳＢＥ-β-ＣＤ;但是在ｐＨ３．０時(shí),由于柱內(nèi)表面還存在大部分未解離的Ｓｉ—ＯＨ,因此使得在柱內(nèi)表面動(dòng)態(tài)吸附表面活性劑的量較少,大部分游離的ＨＤＢ比ＣＴＡＢ更易于與流動(dòng)相中的手性選擇劑相互作用,在高ＳＢＥ＿β＿ＣＤ含量時(shí),使得在流動(dòng)相中的手性選擇劑所起的作用分額減小,因此以ＣＴＡＢ為陽(yáng)離子表面活性劑的雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ對(duì)丙比胺的拆分性能較好。在ｐＨ６．０,以ＨＤＢ所形成的雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ在高手性選擇劑濃度時(shí)丙比胺（華發(fā)林在３０ｍｉｎ內(nèi)未出峰）的Ｒｓ遠(yuǎn)大于ＣＴＡＢ所形成的雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ。這是由于首先柱內(nèi)表面Ｓｉ—ＯＨ解離完全,吸附陽(yáng)離子表面活性劑的量較多;其次ＨＤＢ比ＣＴＡＢ所帶的正電荷密度大,使得在形成第二動(dòng)態(tài)吸附層時(shí)能吸附較多ＳＢＥ-β-ＣＤ的緣故。
２．５雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ和ＣＤ-ＣＺＥ的比較
由表１還可看出緩沖液ｐＨ不管是３.０還是６.０,當(dāng)ＣＴＡＢ濃度為０．２ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí),雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ對(duì)丙比胺的手性分離性能比ＣＤ-ＣＺＥ(ＣＴＡＢ的濃度為０)強(qiáng),這說(shuō)明柱壁所吸附的ＳＢＥ-β-ＣＤ在手性分離中確實(shí)起到了一定的作用;當(dāng)ＣＴＡＢ濃度為０．４ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí)則由于緩沖液中游離的ＣＴＡＢ和分析物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性地與ＳＢＥ-β-ＣＤ相互作用,使得丙比胺的Ｒｓ反而比在ＣＤ-ＣＺＥ情況下小。
以ＨＤＢ作為陽(yáng)離子表面活性劑時(shí),在ｐＨ３．０的緩沖液中ＳＢＥ-β-ＣＤ低含量的情況下,由于在柱壁動(dòng)態(tài)吸附的ＳＢＥ-β-ＣＤ的作用,丙比胺的Ｒｓ在雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ時(shí)遠(yuǎn)大于ＣＤ-ＣＺＥ,而在ＳＢＥ-β-ＣＤ高含量的情況下,則Ｒｓ反而小于ＣＤ-ＣＺＥ,這是由于流動(dòng)相中部分ＳＢＥ-β-ＣＤ與ＨＤＢ相互作用的緣故;當(dāng)緩沖液在ｐＨ６．０時(shí),由于柱壁Ｓｉ—ＯＨ解離增多,使得吸附ＨＤＢ的量增多,進(jìn)而使得柱壁動(dòng)態(tài)吸附ＳＢＥ-β-ＣＤ的量也增多,因此即使是在ＳＢＥ-β-ＣＤ高含量下丙比胺的Ｒｓ在雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ的情況下遠(yuǎn)大于ＣＤ-ＣＺＥ。
２．６雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ的重復(fù)性
考察如下４種背景電解質(zhì)體系下的雙動(dòng)態(tài)吸附柱的重復(fù)性:(１)ｐＨ３．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ;(２)ｐＨ６．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．２ｍｍｏｌ／ＬＣＴＡＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ；(３)ｐＨ３．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．３ｇ／ＬＨＤＢ和２ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ；(４)ｐＨ６．０、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-Ｈ３ＰＯ４、０．３ｇ／ＬＨＤＢ及２ｇ／ＬＳＢＥ-β-ＣＤ。分別以上述４種緩沖液體系連續(xù)運(yùn)行１０次,每次之間用該緩沖液體系浸泡柱子５ｍｉｎ,所得到的丙比胺出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ＲＳＤ)見(jiàn)表２。由表２可知在各緩沖液體系下,丙比胺出峰時(shí)間的ＲＳＤ都小于１．０%,這說(shuō)明雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ不但具有很好的重復(fù)性,而且不同雙動(dòng)態(tài)涂層之間轉(zhuǎn)換既簡(jiǎn)單又快速。
３結(jié)論
雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ可以在低手性選擇劑含量的情況下獲得比ＣＤ-ＣＺＥ理想的手性拆分效果,在高ｐＨ值下或低手性選擇劑含量時(shí),以ＨＤＢ為陽(yáng)離子表面活性劑比ＣＴＡＢ能獲得更好的拆分效果,因此選擇適當(dāng)?shù)碾p動(dòng)態(tài)
ＣＥＣ可為手性分離節(jié)約較為昂貴的手性選擇劑。作為毛細(xì)管電泳的又一分離模式,雙動(dòng)態(tài)吸附ＣＥＣ有值得進(jìn)一步研究的應(yīng)用和理論價(jià)值。
