SDS-Schiff堿銅(II)配合物模擬酶催化光度法研究

    天然過氧化物酶價(jià)格昂貴,且容易失活,對(duì)催化反應(yīng)條件要求苛刻,因此尋求HRP模擬酶顯得尤為重要。但模擬酶僅能模擬輔基結(jié)構(gòu),由于處于游離狀態(tài),其催化活性和特異性均不如天然酶。而創(chuàng)造適宜的微環(huán)境可有效提高模擬酶的催化活性。本文發(fā)現(xiàn)Schiff堿銅配合物Cu(II)-(HNATS)₂模擬酶具有類似辣根過氧化物酶(HRP)的催化活性,而陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的加入改善了模擬酶所處的微環(huán)境,其增溶、增敏的雙重作用使模擬酶的催化活性、穩(wěn)定性和催化顯色反應(yīng)的靈敏度均顯著提高。由此建立了新的測(cè)定超氧陰離子自由基(O·^-₂)的分光光度法。線性范圍為0~9.0×10^-4mol/L,檢出限為6.28×10^-6mol/L。30種干擾物質(zhì)試驗(yàn)證明,大多數(shù)生物樣品中共存物質(zhì)無干擾。此法可望成為測(cè)定超氧陰離子自由基(O·^-₂)與超氧化物歧化酶(SOD)活性的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 UV-265型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津);pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);PE983型紅外光譜儀(KBr壓片,美國(guó)Perkin-Elmer公司);MT-3型CHN元素分析儀(日本柳本公司);高壓汞燈(南京工學(xué)院電子管廠,附365,405,546和577nm濾光片)。

維生素B₂(VB₂):用0.1mol/LNaOH配成4×10^-4mol/L溶液。4-氨基安替比林(4-AAP)配成2.0×10^-2mol/L水溶液。2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)水溶液:2.0×10^-2mol/L。H₂O₂水溶液:5.0×10^-3mol/L,用30%H₂O₂溶液稀釋(KMnO4標(biāo)定)。2-羥基-1-萘醛縮2-氨基噻唑銅配合物[Cu(II)-(HNATS)₂]為自合成,配成5.0×10^-4mol/LDMF溶液。各類表面活性劑濃度均為1.0×10^-2mol/L。Tris-HCl緩沖溶液0.10mol/L,pH=8.50。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,水為二次蒸餾水。

1.2 SOD酶提取液的制備 分別將市售大蒜、大蔥和洋蔥鮮品去皮、去根、洗凈晾干,按每克可食部分加2mL50mmol/LpH=7.8的磷酸鹽緩沖液,冷凍2h后制成勻漿,定容,將濾液冷凍1h后離心(4000r/min)10min,向上清液中加預(yù)冷無水乙醇及氯仿各0.5mL,用混合器振蕩混勻1min,離心(4000r/min)5min,將上清液放入透析袋,于pH7.8磷酸鹽緩沖液中透析72h,經(jīng)濃縮得SOD提取液,備用。

1.3 Cu(II)-(HNATS)₂的合成與鑒定 參考文獻(xiàn)方法,合成新型Schiff堿銅配合物Cu(II)-(HNATS)₂模擬酶,并通過了紅外和元素分析。推測(cè)模擬酶可能的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 在10mL刻度比色管中依次加入2.5mLTris-HCl緩沖溶液(pH=8.50)、3mLSDS溶液、0.3mLCu(II)-(HNATS)2溶液、0.8mL4-AAP溶液、1.8mL2,4-DCP溶液及0.2mLVB2溶液,用水稀釋至刻度,搖勻,置于高壓汞燈下光照,參比液不光照,在分光光度計(jì)上于505nm處測(cè)定吸光度A。記錄A隨光照時(shí)間的變化曲線(動(dòng)力學(xué)方法)及達(dá)平衡時(shí)的A值(靜態(tài)平 衡法)。樣品分析時(shí)注入SOD抽提液25μL,光照20min,記錄A_505nm,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與討論

2.1 吸收曲線 繪制吸收曲線(如圖2,光照時(shí)間20min)。比較各體系產(chǎn)物吸收曲線(400~700nm),峰形相同,最大吸收波長(zhǎng)均在505nm,說明所得產(chǎn)物為同一醌型化合物。圖2曲線a表明在無催化劑存在下反應(yīng)微弱;曲線b表明模擬酶Cu(II)-(HNATS)₂對(duì)反應(yīng)催化作用較強(qiáng);曲線c表明SDS可明顯提高模擬酶的催化活性,其最大吸收峰位不變;曲線d表明HRP對(duì)反應(yīng)有很好的催化效果。選擇505nm為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 酸度的影響 在pH=3.0~12.0范圍內(nèi)研究了體系酸度的影響。結(jié)果表明,在pH=8.0~9.0范圍內(nèi),吸光度A穩(wěn)定且有最大值。本文選0.1mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.50)2.0mL。

2.3 試劑用量的選擇 研究結(jié)果表明,試劑最佳用量分別為:1.8mL2.0×10^-2mol/L2,4-DCP溶液;0.8mL2.0×10^-2mol/L4-AAP溶液;0.3mL5.0×10^-4mol/LCu(II)-(HNATS)₂溶液;0.2mL4×10^-4mol/LVB₂溶液。

2.4 光照波長(zhǎng)及時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,混合波長(zhǎng)(即不附加任何的濾光片)的光照方法為最佳。在0~20min內(nèi),吸光度A與光照時(shí)間t具有良好的線性關(guān)系,此期間吸光度變化值與酶活力成正比。在25~40min內(nèi)反應(yīng)速率變慢,曲線彎曲。本文選擇光照時(shí)間為20min。

2.5 表面活性劑的影響 研究各種類型表面活性劑和β-CD對(duì)反應(yīng)的影響,結(jié)果列于表1。由表1可見,陰離子表面活性劑SDS和β-CD對(duì)反應(yīng)有明顯的增敏作用,與不加表面活性劑體系相比,分別增敏25.2%和21.1%。而陽(yáng)離子和非離子表面活性劑均有不同的抑制作用。

SDS濃度在2.5×10^-3~3.5×10^-3mol/L范圍內(nèi),吸光度A穩(wěn)定且有最大值,加入量過多,由于妨礙了模擬酶與反應(yīng)體系間的相互接觸,催化效果受到抑制,吸光度明顯降低。本文選用1.0×10^-2mol/L的SDS3mL為最佳。

2.6 模擬酶的特性分析 按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線法求出Cu(II )-(HNATS)₂模擬酶(I)與SDS-Cu(II)-(HNATS)₂模擬酶( II)的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)(表2)。由表2可見,加入SDS使模擬酶的催化活性和專一性顯著提高。

2.7 酶催化反應(yīng)及表面活性劑增敏機(jī)理的探討 該催化偶聯(lián)顯色反應(yīng)可能的機(jī)理如下:

SDS對(duì)模擬酶的增敏效果顯著,但最大吸收波長(zhǎng)未發(fā)生改變(見圖2),說明并無新的化合物生成,只是改變了模擬酶所處的微環(huán)境。SDS與Cu(II)-(HNATS)₂模擬酶間的靜電吸引對(duì)模擬酶有一定的固定作用,客觀上起到穩(wěn)定模擬酶和提高其活性的作用。

2.8 測(cè)定干擾物質(zhì)的實(shí)驗(yàn) 取VB2濃度為8.0×10^-6mol/L,考察了30種無機(jī)離子和有機(jī)物的干擾,即1000倍以上的Ca²⁺,Cl^-,NO^-₃,Ac^-,SO^2-₄,Br^-,F^-;900倍的Mg²⁺;600倍的Sr²⁺,Ni²⁺;250倍的PO^3-₄,CO^2-₃;200倍的蔗糖,葡萄糖;80倍的Be²⁺;60倍的Al³⁺;50倍的色氨酸,DL-酪氨酸,I-,Zn²⁺;30倍的Cr³⁺;25倍的甘氨酸,L-苯丙氨酸,Pb²⁺;15倍的Hg²⁺;5倍的Fe³⁺;1倍的Co²⁺,Mn²⁺,V⁵⁺,SO^2-3。

2.9 工作曲線 根據(jù)2O^·-2+2H⁺=H₂O₂+O₂可知,2molO^·-₂可產(chǎn)生1molH₂O₂,故可用H₂O₂濃度與A₅₀₅的線性關(guān)系表達(dá)O^·-₂量的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明,O^·-₂在0~9.0×10^-4mol/L與A505存在線性關(guān)系。工作曲線回歸方程為A=0.09787+1002.5×c(O^·-2)/(mol·L^-1)。r=0.9984。10份空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0021,檢出限為6.28×10^-6mol/L。

2.10 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 本法可用于大蒜、大蔥、洋蔥中SOD活性的測(cè)定。并與鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了比較,結(jié)果見表3。