測定抗壞血酸的亞甲藍褪色光度法

壞血酸(又稱維生素C),普遍存在于水果和蔬菜中,是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)和藥物,也是一種用途廣泛的工業(yè)原料｡人體如果缺乏維生素C將導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生,嚴重時將導(dǎo)致壞血病､心臟及肝臟損傷等疾病｡同時,維生素C在醫(yī)院臨床上用于輔助治療壞血病､藥物中毒､癌癥等疾病,具有消除人體自由基､防止關(guān)節(jié)腫大､促進外傷愈合､增強機體抵抗能力等作用｡因此,食品､飲料､醫(yī)藥､醫(yī)療等行業(yè)都需要進行維生素C含量的測定｡
    目前測定維生素C含量有多種方法,主要包括用I₂或其他氧化劑進行氧化還原滴定､毛細管電色譜法以及采用化學(xué)發(fā)光光度法､動力學(xué)分光光度法､直接光度法等｡這些方法各有長處,但有些需使用昂貴的儀器,有些操作繁瑣､選擇性差｡本文采用的亞甲藍褪色光度法能夠方便地測定還原態(tài)的抗壞血酸,具有良好的選擇性,同時還具有儀器設(shè)備簡單､操作簡便､準確可靠等特點;應(yīng)用于飲料､藥品等樣品中抗壞血酸的現(xiàn)場測定,得到滿意結(jié)果｡

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

722型光柵分光光度計(山東高密分析儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(江蘇南通縣通海電器廠)｡抗壞血酸(維生素C):沈陽試劑一廠產(chǎn)品,分析純;亞甲藍:天津石英鐘廠霸州化工廠產(chǎn)品,分析純;無水對氨基苯磺酸鈉:同濟微量元素研究所產(chǎn)品,分析純;鹽酸和氯化鉀:天津市化學(xué)試劑一廠產(chǎn)品,均為分析純試劑｡

抗壞血酸溶液:準確取0.1g抗壞血酸溶于少量蒸餾水中,放入100mL棕色容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此溶液的抗壞血酸含量為1.0g/L,作為儲備液,使用時現(xiàn)用現(xiàn)配,稀釋成含量為100mg/L｡鹽酸儲備液:用移液管移取8.4mL鹽酸,放入100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此溶液鹽酸濃度為1.0mol/L｡氯化鉀儲備液:準確稱取39.3333g氯化鉀,溶于水中,放入100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此溶液氯化鉀濃度為5.3mol/L｡緩沖溶液(pH=2):準確移取10mL鹽酸儲備液和20mL氯化鉀儲備液至100mL的容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此緩沖溶液的酸度為pH=2.0｡亞甲藍溶液:準確稱取100mg亞甲藍溶于少量水中,放入100mL的容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此溶液的質(zhì)量濃度為1g/L,使用時用水稀釋成100mg/L｡對氨基苯磺酸溶液:準確稱取100mg對氨基苯磺酸溶于少量蒸餾水中,放入100mL的容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,此溶液的質(zhì)量濃度為1g/L｡

本實驗所用的水均為二次蒸餾水｡

1.2實驗方法

取兩支25mL帶塞比色管,分別加入100mg/L亞甲藍溶液1mL､1g/L無水對氨基苯磺酸溶液2mL､pH=2的緩沖溶液5mL｡其中一支再加入1.0g/L的抗壞血酸標準溶液1mL,用蒸餾水稀釋至刻度線,搖勻,放入25℃的水浴鍋中保溫20min,取出,在波長660nm處,以未加抗壞血酸工作液為參比,測定吸光度;并以吸光度的絕對值為縱坐標,以抗壞血酸的用量(體積數(shù)mL)為橫坐標繪制標準曲線｡

2結(jié)果與討論

2.1吸收光譜

亞甲藍的最大吸收波長在加入抗壞血酸前后沒有變化,仍然為660nm,如圖1,因此,選擇660nm為測定波長｡圖1中曲線1是沒有加抗壞血酸時亞甲藍的吸收光譜,曲線2則是添加了抗壞血酸時的光譜圖,表明抗壞血酸對亞甲藍有明顯的褪色作用｡

2.2酸度及緩沖溶液､亞甲藍用量的影響

實驗考察了酸度對亞甲藍褪色反應(yīng)的影響,結(jié)果如圖2所示｡從圖2可以看出,在pH=0~3的酸度范圍內(nèi),|A|值比較穩(wěn)定,所以選定pH=2為測定酸度｡

實驗還考察了緩沖溶液用量對褪色反應(yīng)的影響,pH=2的緩沖溶液的用量對褪色反應(yīng)的影響并不明顯,當其用量在5mL時,吸光度|A|有最大值且比較穩(wěn)定,因此選定緩沖溶液的最佳用量為5mL｡

亞甲藍的用量如果不足,較高濃度的抗壞血酸就不能準確測定;如果太大,低濃度的抗壞血酸也難于準確測定,檢出限將會提高｡因此,優(yōu)化亞甲藍的用量可以在保證準確測定高濃度抗壞血酸的情況下盡可能降低檢出限,拓寬工作曲線的線性范圍｡實驗表明,對于40mg/L抗壞血酸溶液,當亞甲藍的用量在0.5~3mL時|A|的值較大而且穩(wěn)定;當亞甲藍的用量超過3mL時,由于參比溶液的顏色太深而無法讀數(shù),同時也降低了檢測低濃度抗壞血酸的能力｡因此,選擇亞甲藍的用量為1mL｡

2.3增敏劑的選擇及其用量的影響

為了尋找合適的增敏劑,本實驗考察了甲醇､乙醇､乙二醇､丙三醇､甲酸､乙酸､苯甲酸､對氨基苯磺酸､水楊酸､檸檬酸､酒石酸､H_酸､苯酚､丙酮､十二烷基苯磺酸鈉､十二烷基硫酸鈉､十六烷基溴代吡啶､吐溫-80､乳化劑-OP､淀粉､環(huán)糊精､EDTA等物質(zhì)對|A|的影響｡實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有高濃度的EDTA和對氨基苯磺酸對抗壞血酸和亞甲藍的反應(yīng)有增敏作用,而其它物質(zhì)幾乎沒有影響;并且發(fā)現(xiàn)對氨基苯磺酸的增敏作用遠大于EDTA,所以本實驗選擇對氨基苯磺酸為增敏劑,同時考察了其用量的影響,其溶液用量在1mL到4mL范圍內(nèi)時|A|的值最大而且恒定,因此選擇對氨基苯磺酸溶液的用量為2mL｡

2.4反應(yīng)時間及溫度的影響

根據(jù)實驗方法,在加入抗壞血酸后每5min測量一組數(shù)據(jù),連續(xù)監(jiān)測90min｡結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和亞甲藍能夠較快反應(yīng),|A|在15~30min內(nèi)達到最大并保持穩(wěn)定,但在30min后將緩慢地略有增大,到50min后基本保持恒定｡由于其增加的幅度小于5%,因此仍然選擇褪色反應(yīng)的時間為20min｡實驗考察了溫度對褪色反應(yīng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在較高溫度(50℃以上)下,褪色反應(yīng)明顯加快,但是靈敏度沒有明顯提高;在較低溫度(10~30℃)下,在反應(yīng)進行20min后進行測量時,溫度對褪色反應(yīng)的影響可以忽略不計｡因此,為了操作的方便,選擇在25℃(室溫)條件下進行測量｡

2.5標準曲線與檢出限

在實驗確定的最佳條件下,改變抗壞血酸的加入量,按照實驗方法繪制標準曲線｡本法測定抗壞血酸的線性范圍是0.4~40mg/L,曲線的回歸方程為|A|=3.934C+0.00518(C的單位為mg/L),r=0.9989,標準偏差s=0.0101(n=6),檢出限為0.4mg/L(S/N=3σ)｡

2.6干擾實驗

實驗中分別考察了甲醇､乙醇､乙二醇､丙三醇､甲酸､乙酸､苯甲酸､水楊酸､檸檬酸､酒石酸､H_酸､苯酚､丙酮､十二烷基苯磺酸鈉､十二烷基硫酸鈉､十六烷基溴代吡啶､吐溫-80､乳化劑-OP､淀粉､聚乙烯吡咯烷酮､環(huán)糊精､EDTA､脲､葡萄糖､乳糖､硫脲､肼､酒石酸､磷酸根､硫酸根､氟離子､氯離子等物質(zhì)對褪色反應(yīng)的影響｡實驗結(jié)果表明,對測定20mg/L的抗壞血酸,誤差≤±5%時,允許如下倍量的物質(zhì)存在:2500倍的葡萄糖;125倍的EDTA;其他試劑幾乎沒有影響;高價鐵離子等強氧化性金屬離子對本法有干擾,但是因為它們不能和抗壞血酸共存,在實際分析中可以不考慮｡因此,本法具有優(yōu)良的選擇性｡

2.7樣品分析

2.7.1維生素C藥片中抗壞血酸的測定準確稱取0.1563g已研碎的吉林市制藥廠產(chǎn)的維生素C藥片,溶于蒸餾水中,完全轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度｡分取1mL溶液,按實驗方法項下進行測量,結(jié)果列于表1｡

2.7.2飲料中抗壞血酸的測定取瑞士雀巢食品公司生產(chǎn)的“必是”牌荔枝速溶飲品10g,溶于少量蒸餾水中,完全轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度｡溶液澄清后,移取1mL,按照實驗方法項下進行測定,結(jié)果見表1｡

2.7.3蔬菜中維生素C含量的測定 取市售新鮮的西紅柿參照文獻處理后,移取上清液2mL,按照實驗方法項下進行檢測,結(jié)果如表1所示｡

所有樣品的測定結(jié)果均采用2,4_二硝基苯肼標準分析方法進行對照,其結(jié)果也列入表1中｡從表1可以看出,采用亞甲藍褪色光度法測定抗壞血酸所得結(jié)果與標準法結(jié)果一致｡

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