金屬卟啉,包括天然存在的氯化血紅素(Ｈｅｍｉｎ),是一類具有超分子功能的配合物,在仿生化學(xué)中廣泛用作氧輸送、細(xì)胞色素等的模型物,也能催化ＤＮＡ鏈的氧化斷裂,在分析化學(xué)中可作為過氧化物酶、過氧化氫酶的模擬酶使用。金屬卟啉的其他催化行為和可否作為其他氧化酶的模擬物,引起了人們的興趣。例如,最近有人報(bào)道了Ｈｅｍｉｎ催化青蒿素在玻碳電極上的還原。文獻(xiàn)研究了強(qiáng)堿性介質(zhì)中不外加氧化劑的魯米諾化學(xué)發(fā)光體系中金屬卟啉的催化活性,但反應(yīng)機(jī)理仍不很清楚。此外,以表面活性劑膠束為代表的分子組裝體在動力學(xué)體系中的作用受到重視。
在研究辣根過氧化物酶與Ｈｅｍｉｎ對Ｈ2Ｏ2氧化溴鄰苯三酚紅(ＢＰＲ)反應(yīng)體系的催化作用與分析特性的基礎(chǔ)上,本文研究了在不加Ｈ2Ｏ2的體系中,Ｈｅｍｉｎ在十二烷基苯磺酸鈉(ＳＤＢＳ)陰離子表面活性劑共存下對ＢＰＲ的氧化褪色反應(yīng)。結(jié)果表明,溶解氧作為ＢＰＲ的氧化劑參加反應(yīng),Ｈｅｍｉｎ的催化行為類似于酶催化,并能為乙醇和ＳＤＢＳ增效。測定了有關(guān)動力學(xué)常數(shù),初步討論了反應(yīng)機(jī)理。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1. 1 儀器與試劑
ＵＶ-240記錄式雙光束分光光度計(jì),附ＴＢ 85型恒溫水浴箱(日本島津)。吸光度測量均用10ｍｍ吸收池。ｐＨＳ 2酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)。
3. 0×10-4ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ:用0 05ｍｏｌ/ＬＫＯＨ溶解19 6ｍｇＨｅｍｉｎ(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)并稀釋至100ｍＬ,于冰箱中冷藏貯存。工作溶液用0. 1ｍｏｌ/ＬＮＨ3·Ｈ2Ｏ ＮＨ4Ｃｌ緩沖溶液(ｐＨ8. 6)稀釋至所需濃度。用純化后的ＢＰＲ配制2. 0×10-4ｍｏｌ/Ｌ溶液,避光貯存時(shí)至少可穩(wěn)定15天(吸光度變化<5%),濃度用分光光度法按ｐＨ5. 6～7. 5時(shí)ε558=5. 45×104Ｌ·ｍｏｌ-1·ｃｍ-1標(biāo)定。ＳＤＢＳ(Ｆｌｕｋａ)2. 0×10-2ｍｏｌ/Ｌ的溶液。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1 動力學(xué)常數(shù)的測定.
在20℃時(shí)用ＳＤＢＳ溶液12 5ｍＬ,乙醇37 5ｍＬ,緩沖溶液12. 5ｍＬ與水配成100ｍＬ混合液(使用前臨時(shí)配制)。在10ｍｍ吸收池中,注入不同量(50～250μＬ)的ＢＰＲ溶液,加入混合液2 0ｍＬ,加水補(bǔ)至2. 45ｍＬ,加入3 .0×10-5ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ50μＬ,迅速混勻,記錄565ｎｍ處以水為參比的吸光度 時(shí)間(Ａ-ｔ)曲線,求出反應(yīng)初速度ｖ,由不同ＢＰＲ濃度對應(yīng)的ｖ,以Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ-Ｂｕｒｋ作圖法計(jì)算動力學(xué)常數(shù)。
1. 2. 2 平衡法測定Ｈｅｍｉｎ
于10ｍＬ比色管中,依次加入ＢＰＲ溶液2. 0ｍＬ,ＳＤＢＳ溶液1 .0ｍＬ,乙醇3 .0ｍＬ,緩沖溶液1. 0ｍＬ,不加Ｈｅｍｉｎ(作為空白)或加入適量的3 .0×10-6ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ溶液,以水定容。室溫下放置30ｍｉｎ后,在565ｎｍ處以水為參比,測量吸光度Ａ0或Ａ,計(jì)算ΔＡ=Ａ0-Ａ值。
1. 2 .3 動力學(xué)法測定Ｈｅｍｉｎ
在20℃時(shí)用ＢＰＲ溶液20. 0ｍＬ,ＳＤＢＳ溶液10. 0ｍＬ,乙醇30 0ｍＬ,緩沖溶液10. 0ｍＬ與水配成100ｍＬ混合液(使用前臨時(shí)配制)。在10ｍｍ吸收池中,加入2 .50ｍＬ混合液,注入適當(dāng)濃度的Ｈｅｍｉｎ25μＬ,迅速混勻后,在565ｎｍ處,以水為參比,記錄Ａ-ｔ曲線,求出反應(yīng)初速度ｖ。由ｖ對Ｈｅｍｉｎ濃度ＣＨｅｍｉｎ作圖。
2結(jié)果與討論
2. 1 反應(yīng)因素對Ｈｅｍｉｎ催化活性的影響
用平衡法測量3 .0×10-7ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ存在下體系的ΔＡ,以考查反應(yīng)因素影響。
2.1. 1 酸度及緩沖介質(zhì)
試驗(yàn)了ｐＨ5 .0～11. 0的多種緩沖介質(zhì)(ＨＡｃ-ＮａＡｃ、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ＮＨ3·Ｈ2Ｏ ＮＨ4Ｃｌ、硼砂 -ＨＣｌ、ＫＨ2ＰＯ4 -硼砂)的影響。表明在弱酸性、中性和弱堿性介質(zhì)中,Ｈｅｍｉｎ均有活性,但在弱堿性介質(zhì)中Ｈｅｍｉｎ的活性較高。除ｐＨ11 0外,ｐＨ8 .0～11. 0時(shí)體系的吸收峰為563～565ｎｍ。相同ｐＨ的不同介質(zhì)中Ｈｅｍｉｎ的催化活性不同,即ＮＨ3·Ｈ2Ｏ ＮＨ4Ｃｌ>ＫＨ2ＰＯ4-硼砂>Ｔｒｉｓ- ＨＣｌ>硼砂- ＨＣｌ。試驗(yàn)表明,ｐＨ8. 0～8 .9ＮＨ3·Ｈ2Ｏ- ＮＨ4Ｃｌ緩沖介質(zhì)中ΔＡ基本不變且最大。本文選用ｐＨ8 .6ＮＨ3·Ｈ2Ｏ- ＮＨ4Ｃｌ溶液,其濃度為1. 0ｍｏｌ/Ｌ時(shí),0. 5ｍＬ以上ΔＡ恒定(2. 0ｍＬ以上未試驗(yàn))。
2 .1. 2 試劑及其濃度
隨乙醇用量增加,ＢＰＲ的吸收峰將由無乙醇時(shí)的556ｎｍ逐漸紅移至565ｎｍ,且溶液吸光度顯著增加。在ＳＤＢＳ存在下乙醇增敏Ｈｅｍｉｎ的催化活性,與無乙醇相比,體系中有30%乙醇時(shí),空白溶液吸光度增高約25%,ΔＡ提高約47%。
在1. 0×10-5～5 .0×10-5ｍｏｌ/Ｌ范圍內(nèi)試驗(yàn)ＢＰＲ濃度的影響,表明在3 .0×10-5～5 .0×10-5ｍｏｌ/Ｌ內(nèi),ΔＡ恒定。因濃度再大,Ａ0、Ａ值過大,不利于準(zhǔn)確測量,故未試驗(yàn)更高濃度。選用4 .0×10-5ｍｏｌ/ＬＢＰＲ。
無陰離子表面活性劑時(shí),有無3. 0×10-7ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ體系在565ｎｍ的吸光度無明顯差異且在2 0ｈ內(nèi)穩(wěn)定。這與以Ｈｅｍｉｎ-Ｈ2Ｏ2 -ＢＰＲ體系測定Ｈ2Ｏ2時(shí)的現(xiàn)象[9]一致。而在陰離子表面活性劑,如ＳＤＢＳ或十二烷基硫酸鈉(ＳＤＳ),十二烷基磺酸鈉(ＳＬＳ)存在下,有Ｈｅｍｉｎ時(shí)ＢＰＲ溶液逐漸褪色,室溫下約30ｍｉｎ后ΔＡ達(dá)到平衡。進(jìn)一步試驗(yàn)ＳＤＢＳ濃度的影響(圖1),表明大于1 .0×10-3ｍｏｌ/Ｌ時(shí)ΔＡ基本不變。
2. 1. 3 反應(yīng)時(shí)間與溫度
在室溫下,不含Ｈｅｍｉｎ的空白溶液在2 0ｈ內(nèi)基本穩(wěn)定,而Ｈｅｍｉｎ催化的反應(yīng)在30ｍｉｎ內(nèi)已基本達(dá)到平衡,在此后40ｍｉｎ內(nèi),ΔＡ基本不變。而反應(yīng)初速度ｖ在一定時(shí)間范圍內(nèi)不變,時(shí)間范圍與Ｈｅｍｉｎ濃度相關(guān)。當(dāng)Ｈｅｍｉｎ濃度為6 .0×10-7ｍｏｌ/Ｌ時(shí),ｖ在30ｓ內(nèi)保持恒定。如圖2所示,溫度ｔ=30～45℃時(shí),ΔＡ最高且恒定,但空白反應(yīng)也較快,重現(xiàn)性較差,而室溫下(≤30℃)ΔＡ雖稍低,但空白反應(yīng)緩慢,故在室溫下研究Ｈｅｍｉｎ的模擬氧化酶活性。
2. 2 模擬酶催化反應(yīng)特征
2. 2. 1 吸收光譜
不同濃度Ｈｅｍｉｎ存在下,催化體系反應(yīng)30ｍｉｎ后的吸收光譜如圖3,在確定的最佳條件下,反應(yīng)液隨Ｈｅｍｉｎ濃度增加,在565ｎｍ處的吸收峰逐漸降低,而在500ｎｍ附近出
現(xiàn)一吸收峰,直至僅在390ｎｍ有最大吸收,溶液由紅紫色變?yōu)闇\黃色。
2.2. 2 模擬酶動力學(xué)常數(shù)
為探討Ｈｅｍｉｎ催化行為,按Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｍｅｎｔｅｎ酶催化動力學(xué)模型,在20℃測定有關(guān)常數(shù)。由Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ Ｂｕｒｋ雙倒數(shù)曲線法得:
1/ｖ=55.5+2.10×10-3/ＣＢＰＲ,
ｒ=0. 9989(ｎ=5)。
這表明該體系具有酶催化的特性,Ｈｅｍｉｎ可視作一種氧化物模擬酶。在ｐＨ8 .6,εＢＰＲ=4 .60×104Ｌ·ｍｏｌ-1·ｃｍ-1。故米氏常數(shù)Ｋｍ=3 .7×10-5ｍｏｌ/Ｌ,6. 0×10-7ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ存在時(shí)最大反應(yīng)速度ｖｍａｘ=3 .9×10-7ｍｏｌ·Ｌ-1·ｓ-1,催化常數(shù)Ｋｃａｔ=0 .64ｓ-1,專一性常數(shù)Ｋｃａｔ/Ｋｍ=1. 7×104Ｌ·ｍｏｌ-1·ｓ-1。與ＢＰＲ為底物、無膠束存在時(shí)Ｈｅｍｉｎ作為過氧化物模擬酶[9]相比,此條件下Ｋｃａｔ和Ｋｃａｔ/Ｋｍ分別提高約22倍和44倍。
2.2 .3 Ｈｅｍｉｎ定量的工作曲線
用平衡法和初速法均可定量Ｈｅｍｉｎ濃度,線性范圍均為2.0×10-8～6. 0×10-7ｍｏｌ/Ｌ,工作曲線回歸方程分別為:
ΔＡ=0.0035+2.08×106Ｃ, ｒ=0.9997,
ｖ=-ｄＡ/ｄｔ=2.88×10-5+8.09×103Ｃ, ｒ=0.9987, ｎ=5(20℃時(shí))。
用初速法測定空白溶液6次,由3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差求得檢測限為5 .0×10-9ｍｏｌ/Ｌ。與初速法相比,平衡法雖相對費(fèi)時(shí),但精密度高,操作也較簡便。測定3 .0×10-7ｍｏｌ/ＬＨｅｍｉｎ濃度6次,平衡法和初速法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1 5%和6 3%。其實(shí)際應(yīng)用還需進(jìn)一步研究。
2. 3 反應(yīng)機(jī)理探討
由平衡法定量Ｈｅｍｉｎ的靈敏度和ＢＰＲ的摩爾吸光系數(shù)表明,本體系不是ＢＰＲ與Ｈｅｍｉｎ在ＳＤＢＳ存在下的締合反應(yīng)。將各試劑溶液通入氮?dú)饣驓鍤獬鹾?/SPAN>,并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下試驗(yàn),有無Ｈｅｍｉｎ體系并未表現(xiàn)出吸收差異,表明本體系中溶解氧是反應(yīng)底物之一。由空氣在水中溶解度計(jì)算知,10～20℃時(shí)溶解氧濃度約為3. 4×10-4～2. 6×10-4ｍｏｌ/Ｌ,高于選用的ＢＰＲ濃度4. 0×10-5ｍｏｌ/Ｌ。溶解氧對反應(yīng)的作用與堿性條件下金屬卟啉 魯米諾催化體系相同。在足量Ｈｅｍｉｎ(如3. 4×10-6ｍｏｌ/Ｌ)存在下,ＢＰＲ反應(yīng)產(chǎn)物在390ｎｍ有最大吸收,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可能與被Ｈ2Ｏ2氧化相似。
其他陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉也有與ＳＤＢＳ相同的作用。為探討ＳＤＢＳ的作用,在ｐＨ8. 6和ｐＨ5 .0緩沖介質(zhì)中的ＫＩ 淀粉溶液加入ＳＤＢＳ,則溶液由無色很快變?yōu)樗{(lán)色。表明ＳＤＢＳ膠束可能富集溶解氧分子。本體系中,當(dāng)有ＳＤＢＳ而不含Ｈｅｍｉｎ時(shí),溶液吸光度略有降低。表明ＳＤＢＳ無顯著催化活性,起催化作用的是Ｈｅｍｉｎ。吸收光譜表明ＳＤＢＳ與Ｈｅｍｉｎ在30%乙醇介質(zhì)中有較強(qiáng)相互作用。
綜上所述,本文作者認(rèn)為可能是ＳＤＢＳ與Ｈｅｍｉｎ的相互作用和ＳＤＢＳ富集溶解氧分子,非常顯著地提高了Ｈｅｍｉｎ的催化溶解氧氧化ＢＰＲ的活性。乙醇因改變了反應(yīng)微環(huán)境而有增敏作用。反應(yīng)中可能也有自由基ＯＨ-·和Ｏ2-·產(chǎn)生。Ｈｅｍｉｎ既有類似過氧化物酶、過氧化氫酶的活性,也有氧化物酶等的活性。因此,在利用其某種模擬酶催化活性時(shí),應(yīng)注意反應(yīng)條件的控制,以獲得較佳的反應(yīng)選擇性。
