正負(fù)離子表面活性劑與高聚物混合雙水相體系的相行為及蛋白質(zhì)的分配

雙水相體系(Aqueous two-phase systems,簡(jiǎn)稱ATPS)是指某些物質(zhì)的水溶液在一定條件下自發(fā)分離形成的兩個(gè)互不相溶的水相.由于其兩相都是水溶液,可作為萃取體系用于生物活性物質(zhì)的萃取分離及分析.我們?cè)鴪?bào)道了正､負(fù)離子表面活性劑雙水相體系用于蛋白質(zhì)的分離.當(dāng)正､負(fù)離子表面活性劑與某些水溶性高聚物混合時(shí),也可形成雙水相體系.該類雙水相體系可望結(jié)合高聚物雙水相與正負(fù)離子表面活性劑雙水相體系的優(yōu)點(diǎn),作為新的萃取體系,可用于生物活性物質(zhì)的分離及分析.

本文報(bào)道了正､負(fù)離子表面活性劑(溴化十二烷基三乙銨/十二烷基硫酸鈉)與高聚物(葡聚糖､聚乙二醇)混合雙水相體系的形成､相行為及牛血清蛋白和溶菌酶在雙水相體系中的分配以及血紅蛋白在親和雙水相體系中的親和分配.

1  實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

十二烷基硫酸鈉(C₁₂H₂₅SO₄Na,SDS,FLUKA公司)經(jīng)乙醇/水混合溶劑重結(jié)晶.溴化十二烷基三乙銨[C₁₂H₂₅N(C₂H₅)₃Br,C₁₂NE]由溴代十二烷和三乙胺反應(yīng)制得,其方法參見文獻(xiàn).SDS及C₁₂NE均未發(fā)現(xiàn)表面張力最低點(diǎn),說(shuō)明無(wú)其它高表面活性雜質(zhì).所用高聚物聚乙二醇(分子量40000)及葡聚糖(分子量5000000),均為PHAMARCIA公司產(chǎn)品.帶有親和配基的高聚物PEG-IDA-Cu(IDA為iminod iacetate)的合成參照文獻(xiàn).牛血清蛋白(不含脂肪酸,BSA)購(gòu)于Sigma公司,溶菌酶(lysozyme, Boehringer公司)從蛋清中提取.水由去離子水加高錳酸鉀重蒸,其余試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙水相體系的制備及各組份濃度的確定

不同物質(zhì)按表1—表3所示的比例混合,于恒溫水浴中放置24h以上,用肉眼觀察相分離.表面活性劑雙水相形成的判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)各相無(wú)渾濁或沉淀;(2)兩相間存在清晰的界面.表面活性劑的總濃度用表面張力方法測(cè)定,葡聚糖的濃度用旋光法測(cè)定.聚乙二醇濃度由折光率法測(cè)定.

1.2.2        兩相中蛋白質(zhì)濃度､分配系數(shù)及表面張力的測(cè)定

在UV-Vis光譜中測(cè)定λ=280nm處的吸收,確定BSA和溶菌酶濃度;測(cè)定λ=409nm處的吸收,確定血紅蛋白濃度.蛋白質(zhì)分配用分配系數(shù)K(K=ct/cb,ct和cb分別是上下兩相被分離蛋白質(zhì)的平衡濃度)表示.由滴體積法測(cè)定表面張力.

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的形成及相行為

2.1.1 雙水相體系的組成

表1為雙水相體系中兩相的組成.表面活性劑濃度ctotal(C12NE-SDS)=0.075mol/L(以C12NE與SDS的總濃度表示).n(C12NE)/n(SDS)=1.85/1,w(高聚物)=3%.由表1可見,表面活性劑與高聚物分別富集于不同相中.

 2.1.2 高聚物濃度對(duì)雙水相體系的影響

在正負(fù)離子表面活性劑雙水相體系中加入高聚物后,由于其體系粘度增加,導(dǎo)致相分離時(shí)間增加,而相體積比則隨高聚物的加入而下降(表2).

2.1.3 溫度及無(wú)機(jī)鹽對(duì)雙水相體系相行為的影響

 由20~50℃下雙水相的相行為(表3)可見,升溫有利于雙水相的形成,即原來(lái)不分相的體系,在溫度提高后有可能分相,同時(shí)相分離速度隨溫度的升高而加快,而相體積比則隨溫度的升高而降低.研究溫度對(duì)C₁₂NE-SDS與聚乙二醇雙水相體系的影響(表3)表明,對(duì)C₁₂NE-SDS與聚葡糖雙水相體系,溫度的改變亦有相似的變化規(guī)律.