不同類型反膠團(tuán)萃取細(xì)胞色素C的研究

細(xì)胞色素C是一種藥用價(jià)值較高的生物產(chǎn)品,主要用于組織缺氧引起的一系列疾患,如心臟病､腦血管障礙､中毒窒息等｡細(xì)胞色素C本身是一種水溶性蛋白酶,主要存在于動(dòng)物心肌中｡傳統(tǒng)的提取方法(吸附法)存在種種弊端,如生產(chǎn)周期長､操作繁雜､間歇性操作､產(chǎn)品純度較差等,迫切需要技術(shù)的更新?lián)Q代｡

本文采用不同類型的反膠團(tuán)體系提取細(xì)胞色素C,研究了水相pH值､離子強(qiáng)度和相體積比等因素對將細(xì)胞色素C從水相提取到反膠團(tuán)相的影響,初步探討了表面活性劑與蛋白質(zhì)間的作用機(jī)理｡

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

丁二酸二油基酯磺酸鈉(SDSS),自制,熔點(diǎn)36~39°C;丁二酸二(2-乙基己基)酯磺酸鈉(AOT),化學(xué)純,上海恒信化學(xué)試劑公司;三辛基甲基氯化銨(TOMAC),化學(xué)純,Fisher Scientific(香港);細(xì)胞色素C(Cyt-C),藥用,相對分子質(zhì)量為12,000~13,000,等電點(diǎn)為10.7,廣東石歧制藥廠生物工程開發(fā)中心;磷酸二異辛酯(D₂EHPA),化學(xué)純,中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司;異辛烷,分析純,中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司｡

磁力攪拌器,721分光光度計(jì),精密酸度計(jì)｡

1.2 溶液的配制

配制50mmol/LSDSS-D2EHPA/異辛烷(1∶100_{υD2EHPA/υ有})､50mmol/LAOT/異辛烷及100mmol/LTOMAC/正辛醇/異辛烷(0.85∶100_{υ正辛醇/υ有})的反膠團(tuán)溶液;取若干支藥用Cyt-C(15mg/支)溶于水配制成一定濃度的Cyt-C溶液,再將其pH值和離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)到所需值｡

1.3 萃取

將以上配好的反膠團(tuán)溶液和Cyt-C溶液按一定體積比例混合,在磁力攪拌器上提取5min,在2000~3000r/min下離心3~5min,于520nm處測光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出Cyt-C的濃度,計(jì)算萃取率(S_f)｡

2 結(jié)果與討論

2.1 水相pH值對反膠團(tuán)萃取Cyt-C的影響

分別用SDSS-D₂EHPA/異辛烷､AOT/異辛烷和TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團(tuán)溶液提取不同pH值的Cyt-C水溶液,結(jié)果如圖1所示｡在pH<pI(10.7)時(shí),Cyt-C帶正電荷,能被陰離子表面活性劑SDSS和AOT提取,當(dāng)pH>pI時(shí),Cyt-C帶負(fù)電荷,能被陽離子表面活性劑TOMAC提取｡萃取率可達(dá)95%以上｡

由圖1看出,SDSS的pH值可操作范圍最寬,為2.5~9.2,且提取率也最高,為100%;AOT和TOMAC最大提取率分別為97%和96%｡

2.2 離子強(qiáng)度對反膠團(tuán)萃取Cyt-C的影響

分別用SDSS-D₂EHPA/異辛烷､AOT/異辛烷和TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團(tuán)溶液提取不同KCl濃度的Cyt-C水溶液,結(jié)果如圖2所示｡由圖可見,三條曲線有類似的變化行為,即在較高鹽離子濃度一邊萃取率均下降,反之萃取率上升｡當(dāng)SDSS的c_KCl≤2.0mol/L,AOT的c_KCl≤0.4mol/L和TOMAC的c_KCl≤0.1mol/L時(shí),可以獲得較高萃取率:SDSS為100%,AOT大于95%,TOMAC大于80%｡然而,實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),c_KCl過小,如SDSS的c_KCl<0.5mol/L,AOT和TOMAC的c_KCl<0.05mol/L時(shí),有乳化現(xiàn)象,溶液變得混濁,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無法獲得｡由圖2還可看出,SDSS的c_KCl可操作范圍最寬,為0.5~2.0mol/L,且提取率也最高,為100%｡

離子強(qiáng)度對反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在隨著離子強(qiáng)度增大,反膠團(tuán)的內(nèi)表面電荷被中和,雙電層變薄,ξ電位降低,這不僅削弱了蛋白質(zhì)分子與反膠團(tuán)的靜電作用,而且降低了表面活性劑極性頭間的排斥力,使反膠團(tuán)變小,不利于蛋白質(zhì)的萃取｡

2.3 相體積比(υ有/υ水)對反膠團(tuán)萃取Cyt-C的影響

分別用SDSS-D₂EHPA/異辛烷､AOT/異辛烷和TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團(tuán)溶液提取不同相體積比(υ有/υ水)的Cyt-C水溶液,結(jié)果見圖3｡由圖可知,三者變化規(guī)律相同,即提取率均隨υ有/υ水增大而增大｡

 改變相體積比實(shí)際上是改變Cyt-C分子與反膠團(tuán)數(shù)量的比值｡合理的相體積比有利于成本的降低｡

2.4 表面活性劑濃度對反膠團(tuán)萃取Cyt-C的影響

分別用上述三種反膠團(tuán)溶液提取Cyt-C水溶液,表面活性劑濃度對萃取率的影響如圖4所示｡從圖4看出,很低濃度的反膠團(tuán)溶液就可獲得很高的蛋白質(zhì)提取率,顯示出了反膠團(tuán)法萃取蛋白質(zhì)具有高效､低成本的優(yōu)越性｡

2.5 提取時(shí)間對反膠團(tuán)萃取Cyt-C的影響

圖5顯示了分別用SDSS-D₂EHPA/異辛烷､AOT/異辛烷和TOMAC/正辛醇/異辛烷反膠團(tuán)溶液提取Cyt-C水溶液的萃取率隨萃取時(shí)間的變化情況｡由圖看出,三個(gè)體系的差別不大,均在數(shù)分鐘內(nèi)萃取便達(dá)平衡,顯示出反膠團(tuán)法萃取蛋白質(zhì)快速､便捷的特點(diǎn)｡

2.6 反膠團(tuán)單級萃取Cyt-C的機(jī)理

這里的“單級”萃取指正萃取,即將蛋白質(zhì)從水溶液中萃取到有機(jī)相的反膠團(tuán)中(相對來說,反萃取是指從反膠團(tuán)有機(jī)溶液中將蛋白質(zhì)萃取到另一水相中)

反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理尚不十分清楚｡曾先后提出過靜電作用､疏水作用､親和作用等機(jī)理,但一般認(rèn)為決定蛋白質(zhì)在兩相間的分配時(shí),靜電作用是主要的｡然而,對不同類型的反膠團(tuán)體系,其溶解機(jī)理也可能不同｡

本研究結(jié)果表明,陰離子表面活性劑SDSS和AOT形成的反膠團(tuán)萃取Cyt-C恰是在pH<pI,C

yt-C帶正電荷時(shí)發(fā)生,陽離子表面活性劑TOMAC形成的反膠團(tuán)萃取Cyt-C也恰是在pH>pI,Cyt-C帶負(fù)電荷時(shí)發(fā)生,說明該三個(gè)體系對Cyt-C的正萃取是典型的靜電作用機(jī)理｡

3 結(jié)論

在適當(dāng)?shù)臈l件下,SDSS､AOT和TOMAC形成的反膠團(tuán)都能實(shí)現(xiàn)對Cyt-C的萃取,而且高效､迅速､簡便,具有較高的應(yīng)用價(jià)值｡SDSS比AOT和TOMMAC的萃取率更高,可操作的控制條件范圍更寬;AOT不用加助提取劑｡

水相pH值和離子強(qiáng)度對反膠團(tuán)萃取Cyt-C都有較大的影響,選用不同的反膠團(tuán)體系,應(yīng)采用不同的pH值和鹽濃度,最佳的pH值和鹽濃度分別為SDSS:pH=6~7,c_KCl=0.5mol/L;AOT:pH=5~6,c_KCl=0.1~0.4mol/L;TOMAC:pH=13.66,c_KCl=0.01mol/L｡相體積比(υ有/υ水)和萃取時(shí)間對萃取率影響不很大,但相體積比過大或攪拌時(shí)間過長,都可能引起Cyt-C變性｡

SDSS､AOT和TOMAC形成的三種不同的反膠團(tuán)體系正萃取Cyt-C的機(jī)理相同,均為靜電作用機(jī)理｡

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