糖酯是一種廣泛用于食品､化妝品和藥品中的表面活性劑。相對(duì)于其他類型的表面活性劑,糖苷脂肪酸酯具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)它是一種非離子型表面活性劑,具有無毒､無色､無味､生物可降解等優(yōu)良特性;(2)它是一種極好的乳化劑且易于消化;(3)它是由可再生資源經(jīng)生物催化劑催化合成的。此外,有研究報(bào)道糖酯具有抗腫瘤､抑菌和殺蟲等功能,而且適量食用糖苷不飽和脂肪酸酯能降低血液中膽固醇的含量及冠心病的發(fā)病率。國外最新報(bào)道不飽和脂肪酸糖苷酯可用于皮膚化妝品中。傳統(tǒng)的糖苷脂肪酸酯合成方法是化學(xué)法。合成時(shí)一般會(huì)引起糖焦化,產(chǎn)物不純,副產(chǎn)物較多,而利用脂肪酶在非水相體系中催化合成糖苷脂肪酸酯可有效克服以上缺點(diǎn)。近年來國外在此方面已進(jìn)行了一定的探討。本文對(duì)無溶劑體系脂肪酶生物催化合成油酸糖苷酯進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,確定了最適酶促酯化反應(yīng)條件。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 材料脂肪酶:Novozym435(來源于Cand id aantarcticaB型脂肪酶,固定于陰離子樹脂上),酶活在60°C時(shí)為7000PLU/g(Propy1 Laurate Units); Lipozyme RM(來源于Mucor miehei)酶活在70°C為5BAUN/g～6BAUN/g(Batch Acidolysis UnitsNovo),北京Novo Nordisk公司贈(zèng)送。Porcine pancreaticLipase(PPL),酶活110U/mg;Cand ida cylindracea lipase(CCL),酶活1400U/mg;Sigma Chemical Co.USA;油酸(純度90%), Aldrich USA。其余試劑均為分析純。
葡萄糖､甲基葡萄糖苷由上海化學(xué)試劑公司購得,乙基葡萄糖苷和丙基葡萄糖苷均由自己合成。
高溫?fù)u床HZ-9612型,江蘇太倉科教器材廠。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 無溶劑體系中酶的催化反應(yīng) 在敞口小三角瓶中加入3mmol油酸和2.5mmol糖苷,預(yù)熱至相應(yīng)溫度后加入一定量的酶,高溫?fù)u床上反應(yīng)12h～48h,轉(zhuǎn)速為200r/min,定時(shí)取樣。
1.2.2 產(chǎn)物的提取與分析 反應(yīng)混合物冷卻后,加入10mL氯仿溶解產(chǎn)物,過濾除去固定化酶。用薄層層析(TLC)分析和分離所得產(chǎn)物。TLC分析表明乙基葡萄糖苷油酸單酯的Rf值為0.25,乙基葡萄糖苷油酸二酯的Rf值為0.33,而未反應(yīng)完全的油酸的Rf值為0.83,糖苷在此展開體系中基本沒有遷移。TLC展開劑:三氯甲烷∶甲醇∶水∶冰乙酸=90∶8∶1∶1(V/V),顯色劑是φ=0.2的硫酸溶液,105°C加熱15min。自制薄層層析制備板在上述展開體系中分離反應(yīng)產(chǎn)物,刮下相應(yīng)條帶溶于氯仿中,再真空干燥得產(chǎn)物乙基葡萄糖苷單酯純度約為95%,可用于質(zhì)譜分析(中科院上海有機(jī)所分析中心檢測(cè))。HPLC檢測(cè):反應(yīng)結(jié)果采用島津HPLC-SCL檢測(cè)系統(tǒng),色譜柱為C18反相柱,流動(dòng)相為甲醇∶水=95∶5(V/V),檢測(cè)溫度為40℃,流速1mL/min,進(jìn)樣量為10μL,示差檢測(cè)器酶催化反應(yīng)初速率的計(jì)算方法見文獻(xiàn)。
2 結(jié)果與討論
2.1 不同來源酶的選擇
比較4種常用的脂肪酶在無溶劑體系中催化糖和糖苷與油酸的酯化反應(yīng),反應(yīng)條件為:5mmol油酸和5mmol乙基葡萄糖苷,溫度70°C,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,反應(yīng)時(shí)間為24h,只改變酶,觀察不同來源酶對(duì)油酸乙基葡萄糖苷酯合成的影響,結(jié)果見表1。
由表可知CCL和PPL均不能催化此反應(yīng),Novozym 435和Lipozyme則可催化此反應(yīng)。Novozym 435催化能力明顯優(yōu)于Lipozyme,它可使油酸完全轉(zhuǎn)化,且選擇性也高。這可能與底物糖苷的結(jié)構(gòu)有關(guān)。由上可知,以Novozym 435作為催化劑在無溶劑體系可有效地催化合成油酸糖苷酯。以下實(shí)驗(yàn)皆采用Novozym 435作為催化劑。
2.2 糖苷烷基對(duì)反應(yīng)的影響
糖苷是此酯化反應(yīng)的一種底物,糖苷的不同會(huì)顯著影響此催化反應(yīng)的進(jìn)行。在有機(jī)相中酶法合成糖酯的主要障礙是幾乎所有的單糖和二糖都不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑中。極性強(qiáng)的溶劑吡啶和二甲基亞甲酰胺曾被用于催化此酯化反應(yīng),然而這些極性溶劑會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu),引起酶活的迅速喪失,而有機(jī)溶劑的毒性使合成的產(chǎn)物不能用于食品､化妝品和藥品。解決方案之一是以糖苷取代原來的單糖和蔗糖,因?yàn)樘擒盏脑魉鶊F(tuán)可使其易溶于己烷和叔丁醇中,甚至可直接部分溶于脂肪酸中。但不同的糖苷因其所帶基團(tuán)的不同,在反應(yīng)中也表現(xiàn)出不同的結(jié)果。為此在其他反應(yīng)條件恒定的情況下,只改變糖苷,觀察其對(duì)催化反應(yīng)結(jié)果的影響,見圖1。
由圖1可見,葡萄糖和甲基葡萄糖苷無明顯反應(yīng),乙基糖苷和丙基糖苷與油酸反應(yīng)較完全。這主要是在無溶劑體系中乙基糖苷和丙基糖苷與油酸有一定的互溶性,能促使酯化反應(yīng)的進(jìn)行。而葡萄糖或甲基葡萄糖苷只有在以吡啶作溶劑時(shí)才能與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)。由此可見,無溶劑體系要明顯優(yōu)于有機(jī)相體系,一是不引入有毒有機(jī)溶劑,二是減少了有機(jī)溶劑對(duì)酶活的損傷。另外由圖中也可看出以丙基糖苷作為糖原,反應(yīng)速率要高于乙基糖苷,這可能是由于兩者在結(jié)構(gòu)上不同所引起的。
2.3 初始水分的影響
水分對(duì)酶催化反應(yīng)是必要的,它在維持蛋白的活性構(gòu)型方面起著重要的作用。在其他條件不變的情況下,向反應(yīng)體系中加入不同量的水,觀察其對(duì)催化反應(yīng)的影響。水在此反應(yīng)中所起的作用表現(xiàn)為兩方面,一為溶劑作用,二為改變反應(yīng)平衡的作用。而水對(duì)酶的影響主要表現(xiàn)為改變酶的三維構(gòu)象,從而改變酶的選擇性,甚至改變酶的催化特性。
由圖2可看出,隨初始水分的增加,反應(yīng)初速率也相應(yīng)增加;但當(dāng)wH2O初>0.04時(shí),反應(yīng)初速率又隨水分的增加而減小。其主要原因是:(1)水分的適度增加可降低乙基葡萄糖苷的粘度,相應(yīng)減少了外擴(kuò)散的影響,且在初始階段酯化反應(yīng)的逆反應(yīng)水解反應(yīng)表現(xiàn)不明顯;(2)當(dāng)wH2O,初>0.04時(shí),一方面在高溫下酶活開始下降,另一方面逆反應(yīng)也相應(yīng)增強(qiáng),結(jié)果是反應(yīng)初速率相應(yīng)減小。
反應(yīng)24h后終止反應(yīng),檢測(cè)油酸轉(zhuǎn)化率,最終轉(zhuǎn)化率與初始水分的關(guān)系見表2。
初始水分含量高的反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化率低。這主要是水解反應(yīng)隨反應(yīng)的進(jìn)行而表現(xiàn)得越明顯,并最終影響油酸的轉(zhuǎn)化率。需要指出的是雖然此反應(yīng)是在高溫敞口的三角瓶中進(jìn)行的,反應(yīng)過程中既有水分的積累也有水分的蒸發(fā),但在70°C下水分蒸發(fā)不足以消除初始水分對(duì)最終轉(zhuǎn)化率的影響。
2.4 酶濃度的影響
提高酶濃度可減少反應(yīng)時(shí)間,但一般會(huì)增加操作成本。
由圖3可知隨酶濃度的增加油酸轉(zhuǎn)化相應(yīng)加快。在反應(yīng)進(jìn)行8h后,油酸已基本轉(zhuǎn)化完全。但此時(shí)繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間油酸糖苷單酯的含量會(huì)發(fā)生變化,最后以w酶=0.05的單酯含量最高,達(dá)86.55%,酶濃度對(duì)生成油酸糖苷單酯的影響見表3。
酶濃度高對(duì)油酸糖苷單酯的生成不利,這可能是反應(yīng)速率提高后,水來不及揮發(fā)而被酶吸收,從而改變了酶的構(gòu)象,使反應(yīng)向合成二酯和三酯的方向轉(zhuǎn)移;當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間后,體系中的水分會(huì)逐漸減少,反應(yīng)又會(huì)向合成單酯的方向進(jìn)行。所以在本實(shí)驗(yàn)條件下,為保證油酯糖苷單酯的得率最高,酶的最適濃度為w酶=0.05。
2.5 溫度的影響
其他條件不變,反應(yīng)溫度為60°C～90°C,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。
初速率隨溫度增加幾乎成指數(shù)增長,原因是:(1)溫度的升高可增大兩底物間的互溶;(2)溫度的增加,底物乙基葡萄糖苷的粘度降低,外擴(kuò)散阻力減小。
初速率的變化受水分蒸發(fā)的影響,溫度越高,水分蒸發(fā)越多,反應(yīng)自然向酯化方向偏移,所以高溫條件下油酸很快被完全轉(zhuǎn)化。溫度對(duì)酯化反應(yīng)選擇性的影響見表4,溫度越高單酯的選擇性也越高,這主要是體系中酶的構(gòu)象與反應(yīng)中的水分有關(guān),水分越少越有利于單酯的合成;而溫度越高體系中水分蒸發(fā)越快,則反應(yīng)中殘余水分越少。這基本上與Adel-horst的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在其減壓反應(yīng)體系中單酯的含量高達(dá)95%。
2.6 固定化酶Novozym 435的穩(wěn)定性
固定化酶的回收和重復(fù)利用是酶法合成所必須考慮的重要因素。檢測(cè)Novozym435在無溶劑反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性,每批在80°C下反應(yīng)24h檢測(cè)油酸的轉(zhuǎn)化率,共8批,每批反應(yīng)結(jié)束后,乘熱吸取上層產(chǎn)物,再加入相同量的底物繼續(xù)反應(yīng)。8批反應(yīng)后,油酸的轉(zhuǎn)化率仍可達(dá)95%以上,表明Novozym 435在此反應(yīng)條件下有良好的操作穩(wěn)定性。
2.7 質(zhì)譜分析
酶法合成的乙基葡萄糖苷油酸單酯,通過制備硅膠板分離可得純度為95%的單一產(chǎn)物,此產(chǎn)物作質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)顯示分子離子峰有m/z=495.4[M+Na]+和m/z=511.4[M+K]+,正好為乙基葡萄糖苷油酸單酯的相對(duì)分子質(zhì)量。
3 結(jié) 論
在無溶劑體系中以固定化酶Novozym 435催化合成糖苷脂肪酸酯。最適反應(yīng)條件為:溫度80°C,初始水分為0,w酶=0.05,反應(yīng)時(shí)間為12h。固定化酶可重復(fù)使用8次以上,在糖苷稍過量的情況下油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%,而單酯的合成與體系中的水分相關(guān),本實(shí)驗(yàn)中單酯的最高含量可達(dá)88%。
