新型磁性葡聚糖親和吸附劑的制備及在尿激酶純化中的應(yīng)用

1前言
    磁性親和分離技術(shù)是將親和分離技術(shù)的高選擇性、高回收率的特點(diǎn)與磁性材料的磁可導(dǎo)向性相結(jié)合的一種新的分離技術(shù)。該技術(shù)操作簡便、快速,分離效果好,可直接處理渾濁液,現(xiàn)已在蛋白質(zhì)的分離純化、固定化酶技術(shù)、免疫測定、靶向藥物制備、細(xì)胞分離等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

 葡聚糖是應(yīng)用最廣泛的親和分離介質(zhì)之一,它具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和優(yōu)良的色譜性能。作為靶向藥物和磁式細(xì)胞分選(MACS)載體的納米級磁性葡聚糖膠體微粒的制備已有較多報(bào)道,但尚未見微米級磁性葡聚糖微球的制備及其在尿激酶分離純化中應(yīng)用的報(bào)道。本文采用反相懸浮包埋技術(shù)合成了粒徑在50目～300目范圍的磁性葡聚糖微球(MDMS),研究了各種因素對微球制備的影響,并以MDMS為載體分別偶聯(lián)對氨基苯甲脒、Ｌ- 精氨酸甲酯和胍基己酸,制備了5種磁性親和吸附劑,測試了它們對尿激酶粗品的純化效果。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1　試劑與儀器　

 葡聚糖(Ｔ-40,Sigma),Span-80(天津化學(xué)試劑三廠,分析純),環(huán)氧氯丙烷(西安化學(xué)試劑廠,化學(xué)純),6-氨基己酸(AHA,上海試劑三廠,生化試劑),氨基乙酸(Gly,上海康達(dá)氨基酸廠,生化試劑),尿激酶粗品(60IU/mg,西安宏興生化廠);對氨基苯甲脒鹽酸鹽(p ABZ·HCl,Arcos),1-乙基 - (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,Merck);L 精氨酸甲酯(L ArgOCH₃)和胍基己酸(GHA)為自己合成;其他試劑均為分析純或生化試劑,水為二次蒸餾水。

TU-1201型紫外 可見分光光度計(jì)(北京通用儀器設(shè)備公司),Ｓ-570型掃描電鏡(HITACHI)。

2.2　磁性葡聚糖微球的制備　

　采用反相懸浮包埋法制備MDMS。有機(jī)分散相:100mL三頸瓶中加入液體石蠟和二氯乙烷的混合溶液(混合比例見表1)30mL,1. 0mLSpan-80,1. 0mL環(huán)氧氯丙烷。水相:5ｇ葡聚糖,加入1.5mL自制磁流體,5mL質(zhì)量濃度為100ｇ/Ｌ的NaOH水溶液,50mgNaBH₄,攪拌溶解。將水相快速轉(zhuǎn)移至有機(jī)相,室溫下以一定速度攪拌30min,然后升溫至70℃,恒溫?cái)嚢?/SPAN>4ｈ。傾出有機(jī)相,依次用水、體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液、水充分洗滌以除去殘留的有機(jī)相。濕態(tài)篩分。

2.3　磁性葡聚糖親和吸附劑的制備　

　取10mL篩分過的50目～100目的MDMS加入到10mL2mol/Ｌ的NaOH溶液中,在NaBH₄存在下用環(huán)氧氯丙烷活化1ｈ。

經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的MDMS在2mol/Ｌ的Na₂CO₃ NaHCO₃緩沖溶液中與AHA反應(yīng)鍵合上AHA間隔臂分子。然后在體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈水溶液中,以三環(huán)己基碳二亞胺(DCC)為偶聯(lián)試劑偶聯(lián)p-ABZ配體,得到磁性親和吸附劑1;在水溶液中以EDC·HCl為偶聯(lián)試劑偶聯(lián)ｐ-ABZ配體得到磁性親和吸附劑2。

經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的MDMS在2mol/Ｌ的Na₂CO₃ NaHCO₃緩沖溶液中與氨基乙酸(Gly)反應(yīng)鍵合上Gly間隔臂分子,然后在體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈水溶液中,分別以DCC和EDC·HCl為偶聯(lián)試劑偶聯(lián)Ｌ-ArgOCH₃配體,分別得到磁性親和吸附劑3和4。

經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的MDMS在2mol/Ｌ的Na₂CO₃ NaHCO₃緩沖溶液中與乙二胺(EDA)反應(yīng)鍵合上EDA間隔臂分子,然后在水溶液中以EDC·HCl為偶聯(lián)試劑偶聯(lián)GHA配體得到磁性親和吸附劑5。　　磁性親和吸附劑合成的反應(yīng)方程式如下:

2. 4　磁性葡聚糖親和吸附劑對尿激酶粗品的純化　

  磁性親和吸附劑對尿激酶的純化以分批方式進(jìn)行。一定量尿激酶粗品,用15mL0.02mol/Ｌ磷酸鹽緩沖液(PBS)- 0.1mol/LNaCl(其中按0.1ｇ/Ｌ的水平添加Tween-80,ｐＨ7. 2)溶解,然后加入磁性親和吸附劑,緩慢攪拌一段時間。用磁鐵將吸附劑吸附在容器側(cè)壁,吸管吸去上清液及不被磁場吸附的尿激酶粗品中的白色不溶物,并用上述緩沖溶液洗滌3次。然后再用15mL0. 1mol/LNaOAc-0. 4mol/LNaCl(其中按0.1g/L的水平添加Tween.80,pH4 .0)洗脫,磁鐵吸附分離,收集洗脫液。親和吸附劑可以再生,循環(huán)使用。

 用平板法測定尿激酶的活性,Lowery法測定尿激酶的濃度,計(jì)算活性回收率和純化倍數(shù)。

3結(jié)果與討論

3.1　影響MDMS制備的因素　

 不同的制備條件及所得到的結(jié)果見表1。結(jié)果表明,有機(jī)分散相的粘度和密度、有機(jī)相和水相的體積比(Vo/Vw)、表面活性劑Span-80的用量、攪拌速度等對微球的制備都有影響。

3.1. 1　分散相粘度的影響　

 分散相粘度太大或太小均不利于成球。分散相粘度太大,則水相難以在分散相中分散成小液滴;而粘度太小,則不利于保持分散的小液滴的穩(wěn)定性。只有分散相在合適的粘度下,才既能使水相在其中充分分散成小液滴,又能保持小液滴的穩(wěn)定性,得到較好的球形產(chǎn)品。

3.1. 2 Vo/Vw值的影響　

在反相懸浮包埋技術(shù)中,Vo/Vw值對所制備的微球的性能有很大的影響。一般認(rèn)為,反相懸浮成球合適的Vo/Vw值在3～8。適當(dāng)提高Vo/Vw值,可以改善微球的粒徑大小和分布。

3. 1.3　分散相密度的影響　

 分散相的密度對微球的制備有一定的影響。主要表現(xiàn)在影響水相分散成的小液滴的穩(wěn)定性。有機(jī)相的密度與水相的密度越接近,越有利于水相的分散,制備的微球粒徑越小。

3. 1. 4　表面活性劑用量的影響　

 在反相懸浮包埋技術(shù)中,為了使水相更穩(wěn)定地分散在有機(jī)相中,一般要添加油包水型的表面活性劑。可以看出,隨著Span-80用量由零增加到2. 0mL,成球性得到改善,粒徑減小。

3.1. 5　攪拌速度的影響　

 攪拌速度直接影響微球的大小和均勻性。攪拌速度增加,微球粒徑變小;但速度過高,也會破壞分散的穩(wěn)定性并可能使制得的微球破碎,反而不利于成球。

 通過以上研究得出:用18mL液體石蠟加12mL二氯乙烷作有機(jī)分散相,加入1. 0mLSpan-80,攪拌速度為1500ｒ/min,可以得到較好的結(jié)果。

3. 2 MDMS的理化性質(zhì)　

　用以上條件制備的MDMS粒度呈多分散性,粒徑大多在50目～300目,形狀規(guī)則(圖1),其中Fe₃Ｏ₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.2%。它具有良好的磁響應(yīng)性,在外加磁場下能迅速聚集,外加磁場撤去后又能充分分散。

圖1 MDMS的電鏡照片

 將所制備的微球在0.1mol/LHCl中浸泡24ｈ后,沒有檢測到鐵元素,表明其可在酸性溶液中使用。但在TiCl₃溶液中,Fe₃Ｏ₄很快被還原,表明其不適于在此類具有還原性的溶液中使用。

3.3　磁性親和吸附劑對尿激酶分離效果的評價(jià)　

 用所制備的磁性親和吸附劑對尿激酶粗品進(jìn)行純化,其結(jié)果見表2。從表2中可以發(fā)現(xiàn),5種磁性親和吸附劑對尿激酶粗品都有一定的純化作用;經(jīng)過直接一步磁性親和分離純化,有些磁性親和吸附劑對尿激酶的純化得到相當(dāng)滿意的活性回收率和純化倍數(shù),其結(jié)果與文獻(xiàn)上相應(yīng)配體的親和色譜純化結(jié)果相近。

表2　磁性親和吸附劑對尿激酶粗品的分離結(jié)果

3 .3 .1　偶聯(lián)試劑的選擇　

 本文分別選擇了水不溶性的DCC和水溶性的EDC·HCl作為偶聯(lián)試劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水溶性的EDC·HCl不僅操作簡單,而且能更有效的偶聯(lián)配體,對尿激酶的純化效果更好。

3 .3. 2　ｐ-ABZ,Ｌ-ArgOCH₃和GHA作為配體的比較

 用同一種偶聯(lián)方法,以Ｌ-ArgOCH₃作為配體的MDMS對尿激酶粗品進(jìn)行分離,能比現(xiàn)在常用的ｐ-ABZ配體得到更好的效果,說明胍基是一種純化尿激酶的有效配基。GHA比Ｌ-ArgOCH₃和ｐ-ABZ配體的效果差,可能是因?yàn)?/SPAN>GHA含有5個亞甲基,疏水性較強(qiáng),引起一定的非特異性吸附所致。

3.3 .3　磁性親和介質(zhì)用于尿激酶分離的特點(diǎn)　

 在尿激酶粗品中,含有一些不溶解的吸附劑等雜質(zhì),用親和色譜純化時,必須首先離心除去。但使用磁性親和吸附劑則無須此步驟,可直接一步磁性親和分離純化,其結(jié)果與文獻(xiàn)上相應(yīng)配體的親和色譜純化結(jié)果相近,但操作簡單、方便,而且它可以像色譜填料一樣,反復(fù)操作使用。這種分離模式經(jīng)適當(dāng)改造,可用于生物工程和基因工程產(chǎn)品的制備分離,有巨大的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4結(jié)論　

 采用反相懸浮包埋技術(shù)可以制備出粒徑在50目～300目范圍內(nèi)多分散的磁性葡聚糖微球。以磁性葡聚糖微球?yàn)榛|(zhì)的磁性親和吸附劑對尿激酶粗品有良好的純化作用,且操作簡單、速度快、效果好。活性回收率為40. 0%～60 .7%,純化倍數(shù)為14 .9～32.8。

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