石油污染土壤微生物治理技術(shù)是一項(xiàng)極有發(fā)展前景的新技術(shù) . 然而 , 石油中一些烴類化合物因具有較低的溶解度并強(qiáng)烈地吸附到土壤顆粒上 , 限制了微生物對(duì)這些烴類化合物的降解 . 表面活性劑具有增溶､分散等作用 , 能增加難溶烴類化合物在水中的溶解度 .
在微生物治理技術(shù)中 , 土壤中微生物種群構(gòu)成是影響石油降解效率的另一個(gè)直接因素 . 在土壤生態(tài)系統(tǒng)中 , 石油烴降解菌普遍存在 , 但在數(shù)量上和降解效率上差異較大 . 在遼河油田石油污染土壤中存在多種石油烴降解菌 , 它們的除油效果各不相同 . 有關(guān)表面活性劑對(duì)石油降解菌的除油率的影響 , 國內(nèi)很少有報(bào)道 . 為了研究表面活性劑對(duì)微生物除油的影響 , 利用從遼河油田中已分離出四株高效降解石油菌進(jìn)行單獨(dú)除油試驗(yàn) , 以研究表面活性劑對(duì)單一菌株除油率的影響 .
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)土樣
試驗(yàn)用的石油污染土樣 , 取自遼河油田采油井附近 . 土樣取回后 , 經(jīng)碎散、除雜、混勻、密封儲(chǔ)存 . 1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)
已分離出的四株高效石油降解菌 , 經(jīng)鑒定分別為微球菌屬 (Micrococcus sp.) ､黃桿菌屬 (Flavobacterium sp.) ､假單胞菌屬 (Pseudomonas sp.) 和無色桿菌屬 (Achromobacter sp.). 用上述 4 株降解菌進(jìn)行除油試驗(yàn) , 其具體操作過程是 : 從瓊脂斜面培養(yǎng)基上接種純菌于含有石油的 100mL 的液體培養(yǎng)基的無菌瓶內(nèi) , 在 30 ℃條件下培養(yǎng) 48h. 四種菌懸液細(xì)菌的濃度依次為 5.4×108/mL ､ 5.6×108/mL ､ 5.1×108/mL ､ 4.9×108個(gè) /mL. 微生物計(jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法 .
1.3 濕熱滅菌
將玻璃器皿和試驗(yàn)用土樣放入 YQSG 型高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱滅菌 , 在 121 ℃下滅菌 30min.
1.4 試驗(yàn)用藥品
試驗(yàn)中藥品 KH2PO4､ NaNO3､ CHCl3均為分析純 . 試驗(yàn)中使用表面活性劑為 : 十二烷基苯磺酸鈉 (L.R, 分子式為 C12H25 C6H5OSO3Na) 和曲拉通 X-100(L.R, 分子式為 C34 H62O11 ).
1.5 試驗(yàn)方法
本試驗(yàn)采用生物泥漿法 . 將待處理土樣和含有氮､磷營養(yǎng)物無菌的表面活性劑水溶液配成固液比 1 ∶ 10 的懸液放入 HZQ-C 恒溫空氣浴振蕩器中進(jìn)行試驗(yàn) . 溫度為 30 ℃ . 每個(gè)試驗(yàn)用泥漿為 150mg/L, 放置在 250mL 的三角瓶中 , 每瓶接種 5mL 培養(yǎng)的菌液 . 振蕩器轉(zhuǎn)速為 120~130r/min, 處理時(shí)間為 21 天 . 本試驗(yàn)氮源采用 NaNO3, 磷源采用 KH2PO4 .KH 2PO4､ NaNO3配制成試驗(yàn)所需的濃度 , 其濃度依次為 77.3g/L ､ 9.87g/L, 使用時(shí)用移液管準(zhǔn)確量取各 2mL. 在試驗(yàn)過程中 , 生物泥漿的 pH 值在 6.8~8.5 之間 . 1.6 石油量測(cè)定
本試驗(yàn)采用重量法 . 其過程為 : 準(zhǔn)確稱取通過 0.25mm 篩孔土樣 15g, 用氯仿熱浸三次 , 將濾液濾入已稱重的燒杯中 , 在 50~55 ℃水浴上風(fēng)干 , 在將燒杯移入 60~70 ℃烘箱中加熱 4h, 取出后干燥 , 冷卻 0.5h, 稱量 , 增加的重量即為土中的油量 .
2 結(jié)果與討論
2.1 表面活性劑對(duì)菌株除油率的影響
分別選用非離子表面活性劑曲拉通 X—100 和陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉 , 研究表面活性劑對(duì)不同細(xì)菌除油率的影響 . 試驗(yàn)結(jié)果如圖 1 和圖 2 所示 . 
圖 1 十二烷基苯磺酸對(duì)不同菌株除油率的影響
1――無色桿菌;2――假單胞菌;3――黃桿菌;4――微球菌
圖 2 曲拉能 X-100對(duì)不同菌株除油率的影響
1――無色桿菌;2――假單胞菌;3――黃桿菌;4――微球菌
由試驗(yàn)結(jié)果可知 , 不同種表面活性劑對(duì)各種菌株的除油率影響不一 . 由圖 1 可知 , 十二烷基苯磺酸鈉對(duì)不同菌株的除油率在低濃度時(shí)無明顯抑制作用 , 在高濃度時(shí)均有抑制作用 . 當(dāng)濃度達(dá)到 500mg/L 時(shí) , 無色桿菌和黃桿菌幾乎無除油效果 , 而另外兩種菌株假單胞菌和微球菌的除油率受表面活性劑的影響也比較明顯 . 在 500mg/L 時(shí) , 假單胞菌的除油率為 9.69%, 而不添加表面活性劑的對(duì)照樣的除油率為 19.52%, 下降幅度較大 , 為 50.36%. 微球菌的除油率為 2.26%, 其對(duì)照樣的除油率為 29.37%, 除油率下降幅度更大 , 達(dá) 92.31%. 由圖 2 看出 , 曲拉通 X—100 對(duì)不同菌株的除油率也有抑制作用 , 但在高濃度時(shí)其抑制作用較十二烷基苯磺酸鈉小 .
2.2 表面活性劑對(duì)細(xì)菌生長情況的影響
為了進(jìn)一步探討表面活性劑對(duì)細(xì)菌的除油的影響 , 選用了除油率較高的黃桿菌進(jìn)行試驗(yàn)研究 , 以考察表面活性劑對(duì)細(xì)菌的生長活性的影響 . 試驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示 .
圖 3 結(jié)果表明 , 生物泥漿中的細(xì)菌生長活性受表面活性劑影響較大 . 表面活性劑濃度在 50mg/L 時(shí)細(xì)菌的濃度與對(duì)照樣 ( 無表面活性劑 ) 相差不大 . 而在 250mg/L 時(shí) , 細(xì)菌的除油率低于對(duì)照樣 ( 如圖 1 ､ 2), 而此時(shí)細(xì)菌的濃度 ( 如圖 3) 與對(duì)照樣的菌液濃度相比也有明顯的下降 . 另外 , 在本試驗(yàn)的生物泥漿系統(tǒng)中 ,pH 值介于 6.8~8.5 之間 , 能保證細(xì)菌維持良好的生長活性 . 因此 , 在本試驗(yàn)中 pH 值對(duì)細(xì)菌的生長活性影響不大 . 以上結(jié)果表明表面活性劑可能對(duì)細(xì)菌有毒害作用 .
圖 3 表面活性劑對(duì)細(xì)菌生長活性的影響
1――曲拉通;X―100;2――十二烷基苯磺酸鈉
2.3 表面活性劑與細(xì)菌的相互作用機(jī)理
為了探討表面活性劑對(duì)細(xì)菌毒性作用的影響 , 進(jìn)行了如下的試驗(yàn) : 接種 5mL 黃桿菌菌液于含有不同濃度的表面活性劑肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中 , 培養(yǎng) 5d(pH 值為 6.8~8.0), 以觀察表面活性劑對(duì)細(xì)菌毒性的影響 . 試驗(yàn)結(jié)果如圖 4 所示 .
圖 4 表明 , 不同濃度的表面活性劑對(duì)細(xì)菌的生長均有一定的抑制作用 . 表面活性劑濃度越高 , 細(xì)菌的數(shù)量就越低 . 以十二烷基苯磺酸鈉為例 , 當(dāng)濃度為 250mg/L 時(shí) , 每毫升培養(yǎng)基中細(xì)菌的數(shù)量與對(duì)照樣相比下降了 3 個(gè)數(shù)量級(jí) . 本試驗(yàn)表明表面活性劑對(duì)細(xì)菌的生長可能有抑制或毒性作用 .
圖 4 表面活性劑對(duì)細(xì)菌毒性的影響
1 ——曲拉通 X—100;2 ——十二烷基苯磺酸鈉數(shù)
有關(guān)表面活性劑的抑制或毒性作用可能有兩種 :(1) 表面活性劑與細(xì)胞膜的脂質(zhì)物質(zhì)相互作用 , 而破壞了細(xì)胞膜 .(2) 表面活性劑與酶或其他影響細(xì)胞基本功能的蛋白質(zhì)發(fā)生了反應(yīng) . 表面活性劑對(duì)細(xì)菌的毒性隨著碳?xì)滏湹脑鲩L而增長 , 當(dāng)含有聚氧乙烯鏈時(shí) , 則隨著聚氧乙烯鏈加長而降低 . 本試驗(yàn)中曲拉通 X—100 和十二烷基苯磺酸鈉可能與石油烴降解菌發(fā)生了上述兩種作用 , 從而使除油率下降 .
細(xì)菌的細(xì)胞膜是以液態(tài)的脂質(zhì)雙分子層為基架 , 在雙分子層中鑲嵌著具有不同的生理功能的蛋白質(zhì) . 其中雙分子層是由磷脂類型的表面活性劑構(gòu)成的 . 在雙分子層構(gòu)型中 , 在其內(nèi)側(cè)有磷脂的疏水端 , 而在其外表面上有親水基 , 借助于類脂脂肪酸殘基間的疏水力和親水基團(tuán)間的靜電力 , 使膜結(jié)構(gòu)保持相對(duì)的穩(wěn)定性 . 外來表面活性劑分子 ( 如曲拉通 X—100 和十二烷基苯磺酸鈉 ) 可能通過替換或干擾脂質(zhì)雙分子層使細(xì)胞膜遭到破壞 , 造成細(xì)胞內(nèi)的成分破壞甚至死亡 . 也可能外來表面活性劑破壞其滲透性或使其機(jī)械破裂 .
表面活性劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)是極其復(fù)雜的 . 這種反應(yīng)可能是改變酶蛋白的活性和結(jié)構(gòu) , 能溶解和削弱結(jié)構(gòu)蛋白 . 陰離子表面活性劑發(fā)生此反應(yīng)除與分子的疏水部分之間的非離子吸引力有關(guān)外 , 還可能與 pH 值影響表面活性劑與蛋白質(zhì)二者的帶電荷基團(tuán)之間的離子力有關(guān) . 這種反應(yīng)在不同的蛋白質(zhì)與不同的表面活性劑之間各異 , 但都有蛋白質(zhì)的溶解､沉淀以及亞單位的結(jié)合或離解 . 非離子表面活性劑與膜蛋白形成的復(fù)合體或多或少吸附在細(xì)胞膜上 . 形成的活性劑 - 蛋白質(zhì)的復(fù)合體有可能使蛋白質(zhì)從細(xì)胞膜上脫離下來 . 膜蛋白質(zhì)是以球型結(jié)構(gòu)鑲嵌在膜的脂質(zhì)雙分子層中的 , 鑲嵌在膜中的蛋白質(zhì)具有不同結(jié)構(gòu)和功能 . 細(xì)胞膜所具有的各種功能在很大程度上也取決于膜內(nèi)所含的蛋白質(zhì) , 細(xì)胞與周圍的環(huán)境之間的物質(zhì)､能量和信息的交換 , 大多與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)有關(guān) . 而表面活性劑與膜蛋白形成的復(fù)合體妨礙了正常的交換功能 .
在本試驗(yàn)中表面活性劑對(duì)菌株除油有抑制作用 , 可能是表面活性劑的存在發(fā)生了上述反應(yīng) , 妨礙了細(xì)胞膜物質(zhì)的交換或者膜上鑲嵌蛋白的活性 , 影響了石油降解菌除油的效果 .
3 結(jié)束語
通過兩種表面活性劑研究發(fā)現(xiàn) , 陰離子和非離子表面活性劑都對(duì)細(xì)菌除油率有一定的影響 . 其中陰離子表面活性劑對(duì)細(xì)菌的活性具有明顯的抑制作用 , 非離子表面活性劑也有抑制作用 .
在治理石油污染土壤中 , 表面活性劑對(duì)微生物除油的影響非常復(fù)雜 . 有關(guān)表面活性劑的增溶作用對(duì)微生物除油的影響 , 以及表面活性劑對(duì)微生物毒性機(jī)理等方面的研究尚不完善 , 有待于進(jìn)一步研究 .
參考文獻(xiàn) :
[1] 金文標(biāo) , 宋藍(lán)暉 , 董曉利 , 等 . 油污土壤微生物的治理的影響因素 [J]. 環(huán)境保護(hù) ,1998(10):27-28.
[2] 陳世和 , 陳鍵華 , 王士芬 , 等 . 微生物學(xué)原理 [M]. 上海 : 同濟(jì)大學(xué)出版社 ,1992.
[3] 胡家駿 , 周群英 . 環(huán)境工程微生物學(xué) [M]. 北京 : 高等教育出版社 ,1996.
[4] 希金斯 IJ, 伯恩斯 RG. 污染的化學(xué)和微生物學(xué) [M]. 武漢醫(yī)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室等譯 . 北京 : 化學(xué)工業(yè)出版社 ,1981.
