甾體的微生物轉(zhuǎn)化(如羥化反應(yīng)),是在微生物細(xì)胞產(chǎn)生的甾體轉(zhuǎn)化酶(如羥化酶)的催化作用下進(jìn)行的｡一般甾體化合物的水溶性很差(10-4~10-5mol/L),而甾體羥化酶又為胞內(nèi)酶,這就決定了只有擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的底物才能與酶接觸和進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化｡因此整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可分為酶促反應(yīng)(即擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的底物分子在酶催化作用下轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物)和擴(kuò)散(包括底物顆粒的溶解,底物分子向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散和產(chǎn)物分子向細(xì)胞外的擴(kuò)散)兩部分｡其中,底物的溶解被認(rèn)為是該過(guò)程的控制步驟｡因此,促進(jìn)甾體底物/水混懸液中底物的高度分散,加速底物的溶解和底物分子的傳遞,是除優(yōu)化菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶外,提高甾體轉(zhuǎn)化反應(yīng)活性的另一關(guān)鍵因素｡本文將著重報(bào)道復(fù)配型分散劑和超聲處理對(duì)甾體微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中底物分散和溶解性的影響｡
目前較為常用的甾體底物分散劑是TWEEN80等親水親油平衡(HLB)值較大､憎水性較弱的表面活性劑｡但這類(lèi)表面活性劑單獨(dú)用于憎水性甾體底物的分散處理時(shí),效果有限｡而親水親油性不同的表面活性劑復(fù)配得到的混合表面活性劑體系,在潤(rùn)濕､乳化和分散等許多應(yīng)用性能上都比單一組分體系有顯著增效作用,但在甾體轉(zhuǎn)化體系中的應(yīng)用報(bào)道較少｡超聲波是一種波動(dòng)形式,產(chǎn)生化學(xué)效應(yīng)的實(shí)質(zhì)是其空化效應(yīng)｡超聲波的化學(xué)效應(yīng)又可導(dǎo)致湍動(dòng)效應(yīng)､微擾效應(yīng)､界面效應(yīng)和聚能效應(yīng)的產(chǎn)生,在固液分散體系中可比常規(guī)的研磨和攪拌更有效地降低含水懸浮液顆粒的尺寸,并可通過(guò)有效的混合及增強(qiáng)的傳質(zhì)來(lái)提供活化作用｡
1實(shí)驗(yàn)
1. 1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
發(fā)酵菌種為黑根霉(Rhizopus nigrical),反應(yīng)底物為16α-,17α-環(huán)氧黃體酮(16α-,17α-epoxy-4-pregnene-3,20-dione),由天津藥業(yè)有限公司提供｡接種后搖瓶于
1. 2 甾體底物/水混懸液的配制
以分散劑的水溶液為分散介質(zhì),與甾體底物一同研磨制得底物/水混懸液,
分散劑包括:HLB值較大的表面活性劑PSE,HLB值較小的表面活性劑MGE,PSE與MGE的復(fù)配型表面活性劑｡
超聲波發(fā)生器:JY96 -2型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(帶探頭),寧波新芝科器研究所｡
1.3 甾體水溶性的測(cè)定
離心分離甾體水懸液,定量吸取上清液,經(jīng)蒸餾水8倍稀釋后,用752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(波長(zhǎng):242nm,蒸餾水作空白)｡
1.4 底物轉(zhuǎn)化率的分析
取0.
2結(jié)果與討論
2.1 單組分分散劑處理底物對(duì)甾體轉(zhuǎn)化的影響
單組分分散劑PSE用于底物處理對(duì)甾體水溶性和轉(zhuǎn)化率的影響如圖1所示,表明:隨著表面活性劑PSE溶液濃度的增加,溶液中甾體底物的含量增加,溶液吸光度增加(曲線1),但甾體轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)極值后呈下降趨勢(shì)(曲線2)｡表面活性劑的增溶作用是膠團(tuán)形成的直接結(jié)果｡HLB值較大的PSE在水溶液中形成內(nèi)核憎水的膠團(tuán),憎水性的甾體分子通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入膠團(tuán)的憎水內(nèi)核,呈單分子或多個(gè)分子聚集體的狀態(tài)高度分散在水中而得到“溶解”,并成為熱力學(xué)上穩(wěn)定的體系｡因此,隨表面活性劑溶液濃度的增加,膠團(tuán)數(shù)目增加,甾體水溶性(嚴(yán)格地說(shuō),擬溶解度pseudo-water-solubility)增加｡但甾體的微生物酶轉(zhuǎn)化為可逆反應(yīng),過(guò)大的產(chǎn)物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化酶有反饋抑制作用｡較大的甾體溶解度可以顯著加速反應(yīng)初期的轉(zhuǎn)化,但迅速累積的產(chǎn)物會(huì)對(duì)反應(yīng)中､后期的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯阻遏｡因此,就轉(zhuǎn)化過(guò)程整體而言,過(guò)大的甾體溶解度對(duì)底物最終轉(zhuǎn)化率的提高并非有利｡
2.2 復(fù)配分散劑處理底物對(duì)甾體轉(zhuǎn)化的影響
表面活性劑PSE的HLB值較大,因而親水性較強(qiáng)而憎水性較弱｡為使憎水的底物分子更易進(jìn)入膠團(tuán)內(nèi)核而實(shí)現(xiàn)增溶,增強(qiáng)膠團(tuán)內(nèi)部的憎水性是有利的｡我們采用HLB值較小､憎水性較強(qiáng)的表面活性劑MGE適當(dāng)比例與表面活性劑PSE復(fù)配使用,以實(shí)現(xiàn)膠團(tuán)內(nèi)核憎水性和底物增溶效應(yīng)的增強(qiáng)｡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(a)所示,復(fù)配型分散劑PSE-MGE顯著增強(qiáng)了甾體底物的溶解,且達(dá)到同一溶解度所需的表面活性劑用量明顯減少,顯示出混合表面活性劑在應(yīng)用性能上的增效作用｡大多表面活性劑對(duì)微生物菌體的生長(zhǎng)是不利的,因此,相對(duì)于單組分分散劑而言,復(fù)配型分散劑的應(yīng)用有利于在實(shí)現(xiàn)同一程度甾體溶解性增強(qiáng)的同時(shí),減弱對(duì)菌體生長(zhǎng)的負(fù)面影響,維持轉(zhuǎn)化階段菌體的活性｡圖2(b)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)一步說(shuō)明這一點(diǎn):對(duì)于復(fù)配型分散劑PSE-MGE,對(duì)應(yīng)最高底物轉(zhuǎn)化率的PSE用量為0.025%,比PSE單獨(dú)使用時(shí)的最佳濃度0.05%明顯減少｡結(jié)合圖2(a)和(b)可見(jiàn),復(fù)配型和單組分分散劑分別取最佳濃度0 .025%和0 .05%時(shí),對(duì)應(yīng)的底物溶解程度接近,而前者對(duì)應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率高｡
2.3 超聲波處理底物對(duì)甾體轉(zhuǎn)化的影響
如前所述,甾體的溶解是甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的控制步驟｡分散劑的加入,促進(jìn)了底物分子高度分散在水溶液中｡底物顆粒尺寸越小,固液接觸表面積越大,越有利于底物的溶解和擴(kuò)散｡超聲波是比常規(guī)的方法更有效的細(xì)化顆粒､增大傳質(zhì)表面的手段｡而超聲波與分散劑的結(jié)合,則可以消除由于顆粒表面積增加､表面Gibbs自由能增加而導(dǎo)致的多相體系的高度不穩(wěn)定性｡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超聲與分散劑配合使用的效果明顯優(yōu)于分散劑單獨(dú)使用時(shí)的效果;對(duì)于單組分和復(fù)配型分散劑,配合使用較強(qiáng)的超聲聲強(qiáng)(12.4W/cm2)和較短的超聲時(shí)間(5min)時(shí)效果最佳｡值得注意的一點(diǎn)是:即使在高投料量(25mg底物/mL發(fā)酵液)時(shí),復(fù)配型分散劑的效果仍?xún)?yōu)于單組分分散劑,但配合超聲波作用時(shí)復(fù)配型分散劑效果劣于單組分分散劑,表明超聲波和表面活性劑共同作用于甾體底物處理的綜合效應(yīng)有待進(jìn)一步探討｡
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